责编 | 酶美
约三十年前， 科学家们在研究转录因子的功能时，发现许多转录因子除了能形成稳定三维结构的核酸结合结构域外，还有一段对转录因子功能必须，但不能形成稳定结构的低复杂度结构域 （low complexity domain，LCD） ，也就是一段个别种类氨基酸富集的序列【1-4】。在后来的研究中，低复杂度序列 （low complexity sequence，LCS） 被认为是固有性无序域 （intrinsically disordered region，IDR） ，并且发现很多LCS在细胞内的异常聚集与退行性疾病高度相关。然而，低复杂度序列在没有形成结构的情况下，如何行使其生物学功能，以及如何导致退行性疾病的分子机制仍存有疑问。
研究表明，细胞内各种RNA颗粒 （RNA granules） 都富集了含有低复杂度序列 （LCS） 的核酸结合蛋白。2009年，Anthony Hyman实验室通过细胞荧光成像观测到细胞内的RNA颗粒—P granule是动态变化的，具有液体属性【5】。2012年，Steven McKnight实验室发现，核酸结合蛋白的低复杂度结构域 （LCD） 能够通过自相互作用 （self-association） 而发生相变 （phase transition） ，从而促进细胞内RNA颗粒的形成【6】。体外研究发现，这种LCS之间的自相互作用形成了不稳定或可逆的cross-β结构【6】。无论在体内还是体外，LCS之间的相互作用都表现出特异性，比如众多RNA结合蛋白 （如FUS, hnRNPA2, TDP43等） 的LCS通过自相互作用而发生相变／相分离 （phase separation） ，不同RNA结合蛋白的LCS之间也存在特异性相互作用，如由LCS 介导的TDP43和hnRNPA2 之间的相互作用。这些特异性的相互作用也是LCS发挥生物学功能所需要的。随着越来越多的LCS被发现能够通过自相互作用而发生相变，能够发生相变的蛋白种类也不再局限于核酸结合蛋白，比如含有FG结构域的核孔蛋白 （Nucleoporin） 。通常，形成稳定的三级结构能够使蛋白与其它分子之间形成特异相互作用。然而，对于生理状态下LCS之间特异性相互作用的分子基础仍缺乏直接的结构生物学研究。因为LCS参与形成的亚细胞结构及其组分是动态变化的，很难从体内纯化或者在体外进行重组。
一个意想不到的发现
1,6-hexanediol (1,6-HD) 在细胞生物学研究中常被用来解聚细胞内的RNA颗粒。Steven McKnight实验室经过系统研究发现，1,6-HD能够特异地解聚细胞内富集LCS的亚细胞结构，包括多种RNA颗粒，以及核孔复合体等【7-8】。但是令人意想不到的是，细胞骨架结构之一的中间纤维 （intermediate filament） 也能被1,6-HD解聚，而其它细胞骨架结构则不能被1,6-HD解聚，包括actin和microtubule【7】。序列和结构对比显示，中间纤维蛋白也含有LCS，并且其LCS也一直被认为没有结构，却是中间纤维正确组装所必需的。因此，一个跃然纸上的问题便是：无序的LCS是如何帮助中间纤维组装的呢？通过比较细胞内其它能发生相变的LCS和中间纤维的LCS之间的相似性，可以发现：1. 二者参与形成的亚细胞结构都具有动态解聚和组装的特性，细胞通过调控LCS（如翻译后修饰）可控制这些亚细胞结构的解聚和组装；2. 它们在体外都能发生相分离形成液滴（liquid droplet），并形成可逆的类似淀粉样纤维的多聚体；3. 它们参与形成的亚细胞结构和体外相变聚集体都能特异地被1,6-HD解组装；4. 特定位点的单点突变都能导致退行性疾病发生，都会在细胞内形成异常聚集。由于之前的研究已经表明，中间纤维可以由重组蛋白在体外进行组装，具有和内源的中间纤维相同的结构和功能。这使得体外研究LCS在生理条件下的结构状态成为可能。因此，中间纤维或可作为范例用以研究LCS在发挥生物学功能时的结构形式。
中间纤维LCS的结构生物学研究
近日，PNAS杂志在线发表了美国西南医学研究中心Steven McKnight课题组题为Transiently structured head domains control intermediate filament assembly的研究结果，并且PNAS杂志也对此研究发现发表了题为Assembly of neurofilament and desmin filament: headed in the right direction的评注文章。
Mcknight课题组长期致力于研究LCS在体内发挥生物学功能的分子机制，包括LCS在生理条件下发生相变的分子机制。在这篇文章中，McKnight组选取神经组织中的中间纤维蛋白neurofilament light (NFL)和肌肉组织中的中间纤维蛋白desmin作为研究对象。作者发现，NFL和demin的LCS都表现出非常强的自相互作用，在体外能够发生相变而形成水凝胶 （hydrogel） 。当作者将NFL LCS相变后形成的水凝胶 （NFL LCS hydrogel） 与小鼠脑组织裂解液孵育后，发现NFL LCS hydrogel能够非常特异地结合内源的NFL全长蛋白。通过hydrogel binding assay，作者确定了NFL LCS与全长NFL蛋白之间的相互作用来自于LCS之间的自相互作用（图1）。同样，desmin LCS相变后也通过LCS之间的相互作用而结合全长desmin蛋白（图1）。
图1：Hydrogel binding assay显示LCS通过特异性自相互作用与全长蛋白结合。
因此，为了探究LCS发生特异性自相互作用的分子机理及其生物学意义，作者提出了以下问题：1. LCS在发生相变以及特异性相互作用时，是否像具有稳定三维结构的蛋白那样形成了特定结构，而非无序状态？2. 如果单独LCS相变后形成了特定结构，那么此结构是否与正确组装后的中间纤维中LCS的结构，即生理状态下的结构一致，而非体外看到的假象？3. LCS中特定位点的翻译后修饰如何调控LCS的功能？4. 如何理解LCS特定位点发生单点突变后，就能改变LCS的行为，导致退行性疾病的发生？
为了回答问题1，作者利用13C-15N对单独的NFL LCS和desmin LCS进行了标记。标记后的蛋白在体外发生相分离后，利用固相核磁共振 （solid-state NMR） 方法对其结构进行测定。结果显示，NFL和deism的LCS形成了β-strand二级结构（图2）。透射电镜，X-ray衍射以及SDD-AGE实验结果显示，NFL的LCS发生相变后形成了可逆的纤维状聚集，具有cross-β结构特征 (7)。据此可见，NFL和desmin的LCS在体外发生相变后形成了不稳定的类似淀粉样纤维的结构。而正是基于这样的结构基础，使得LCS能够发生特异性的相互作用。
图2：发生相变后的LCS和成熟中间纤维中LCS形成了相同的，富集了β-strand的结构。
针对问题2，作者先用13C-15N对NFL和desmin的LCS进行标记，再利用intein chemistry方法， 成功地将LCS连接到了全长蛋白的剩余部分，从而得到了只有LCS部分被标记的全长蛋白。经过中间纤维组装和固相核磁结构测定，得到了全长蛋白组装成成熟中间纤维后LCS的核磁结构谱。令人非常意外的是，NFL和desmin的LCS在成熟中间纤维中也形成了丰富的β-strand结构，而非之前研究文献或书籍中所描述的无序或无结构状态。通过比较单独LCS体外发生相变后的核磁二维谱和成熟中间纤维中LCS的核磁二维谱，发现二者能够高度重合。这样的结果直接显示了LCS在相变和中间纤维组装过程中形成了相同的结构（图2）。在核磁测定中作者还观察到，生理温度下LCS结构的核磁信号要弱于低温下测得的核磁信号，推测LCS形成了相对动态的结构。作者通过测量 1H-13C cross-polarization (CP) 和 1H-13C insensitive nuclei enhanced by polarization transfer (INEPT) 来分别表征LCS形成相对稳定结构部分的运动和无序部分的运动。结果显示，NFL和desmin的LCS形成了相对动态的蛋白结构。在全长LCS中，部分区域参与形成结构，部分区域仍为无序状态。这或许解释了为什么之前研究未能发现中间纤维的LCS形成了二级结构。
在细胞内，发生在LCS上的翻译后修饰能够调控中间纤维在细胞内的动态组装。比如神经元中，NFL蛋白在神经元胞体位置合成后，为了保持单体状态而被磷酸化修饰 （发生在LCS上） ，然后被运输至需要形成丰富中间纤维的神经元轴突区域，再经过去磷酸化后组装形成中间纤维。然而，关于发生在LCS上的翻译后修饰如何调控全长蛋白组装的分子机制仍不清晰。之前对于核酸结合蛋白的LCS的研究表明，磷酸化修饰可抑制LCS的自相互作用，从而抑制LCS发生相分离。因此，为了回答问题3，作者用hydrogel binding assay测定了磷酸化修饰对NFL LCS和desmi LCS自相互作用的影响，发现磷酸化修饰可以抑制LCS之间的相互作用（图3）。据此，作者认为翻译后修饰通过影响LCS之间的自相互作用来调控中间纤维的组装。同时，该结果也佐证了LCS通过自相互作用形成动态结构来帮助全长蛋白正确组装形成中间纤维。
图3：磷酸化修饰通过抑制LCS的自相互作用解组装中间纤维。
遗传学研究表明，NFL和desmin的 LCS上特定位点发生单突变就能导致退行性疾病。而关于发生在此无序LCS上的单点突变如何导致疾病发生仍没有明确的分子机制。为了回答问题4，作者再次将目光聚焦于LCS的自相互作用。前述研究结果已表明，LCS形成了动态的β-strand丰富的结构。作者发现发生于LCS上的家族性致病遗传单点突变并没有改变LCS形成的主要结构，而是异常地增强了LCS之间的相互作用，改变了LCS结构的动态特性，进而导致了中间纤维的异常组装或聚集（图4）。
图4：致病性家族遗传突变异常地增强了LCS之间的相互作用，改变了LCS结构的动态特性，抑制了中间纤维的正确组装。
综上，此研究发现了LCS通过自相互作用形成了动态的，富含β-strand的结构，从而帮助中间纤维进行正确组装。而非之前研究文献和书籍中所述，LCS处于无序状态。并且基于此LCS形成的动态结构，解释了发生在LCS上的翻译后修饰和致病遗传突变影响中间纤维组装的分子机理。由于中间纤维的LCS与其它被人们发现能够发生相分离或相变的LCS之间的相似性，作者期望此研究结果也可以帮助大家理解其它一些LCS在体内通过特异性相互作用发挥生物学功能的分子机制，并得到实验验证。
文章通讯作者为西南医学中心Steven McKnight教授，第一作者为McKnight组博士后周晓明。美国国立卫生研究院Robert Tycko教授为文章重要合作者。
原文链接：
https://www.pnas.org/content/118/8/e2022121118
制版人：十一
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