点评 | 曹晓风 院士（中科院遗传发育所）杨运桂 研究员（国家生物信息中心）
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RNA上的N6-腺苷酸甲基化 （m6A） 是mRNA上最丰富的RNA修饰，通过特异性识别这一修饰的阅读器蛋白 （reader） 参与各种生物学功能。m6A甲基转移酶基因Mettl3敲除的小鼠在E8.5前就胚胎致死【1】，而大部分m6A阅读器基因的敲除并不导致胚胎致死，包括三个分布在细胞质中主要参与mRNA调控的YTH基因 （Ythdf1-3）【2-4】，提示m6A可能具有其他尚不清楚的重要生物学功能。
组蛋白H3K9me3是异染色质的重要修饰，被发现是分化的细胞重编程到早期胚胎多能性的主要表观遗传障碍【5,6】，由此可知，H3K9me3相关异染色质的建立是细胞命运决定的重要机制。在小鼠胚胎干细胞 （mES细胞） 中，除了组成型异染色质 （着丝粒、端粒等） ，H3K9me3主要标记遍布基因组的逆转录转座子 （Retrotransposons） 上并沉默这些区域。逆转录转座子如ERV、LINE1、IAP上的H3K9me3由SETDB1负责催化，敲除Setdb1 （又称ESET） 会导致这些元件重激活【7】，并使胚胎干细胞转化为具有全能性特征的、类似2细胞期的细胞 （2C-like细胞）（详见BioArt报道：）【8】。那么SETDB1是如何特异性地被募集到逆转录转座子区域的？目前有一些研究揭示，哺乳动物进化过程中会通过含KRAB结构域的锌指蛋白的进化来特异性沉默一部分转座元件和外源逆转录病毒 （KRAB结构域会通过KAP1招募SETDB1）【9】，但这个机制并不覆盖所有被H3K9me3沉默的转座元件，提示还存在未发现的机制。
2021年3月3日，中国科学院广州生物医药与健康研究院陈捷凯课题组在Nature发表题为The RNA m6A reader YTHDC1 silences retrotransposons and guards ES cell identity的研究论文。该研究发现在小鼠胚胎干细胞中，RNA m6A通过其核内阅读器蛋白YTHDC1调控H3K9me3和异染色质形成，从而沉默逆转录转座子元件并限制该细胞转化为2C-like细胞。敲除Ythdc1或Mettl3均可导致逆转录转座子元件的重激活，并伴随SETDB1调控的H3K9me3修饰的大幅度下降，同时胚胎干细胞被重编程为2C-like细胞。这一工作发现RNA m6A指导染色质沉默的新功能，证明逆转录转座元件转录的RNA可以通过m6A-YTHDC1机制募集SETDB1到相关染色质区域并参与细胞命运调控。
在小鼠已知的五个含YTH结构域的m6A阅读器中，YTHDC1是唯一的核内阅读器，同时也是唯一敲除后会像Mettl3敲除一样导致胚胎早期致死的阅读器基因【10】。该工作首先构建了Ythdc1条件敲除的mES细胞系并维持在15%FBS+LIF的常规培养条件下。加入4OHT后，持续表达的CreERT会将Ythdc1基因的7-9号外显子 （编码YTH结构域的大部分） 删除。敲除了Ythdc1的细胞 （Ythdc1-cKO细胞） 增殖受到极大抑制，无法正常维持。有趣的是，研究者发现Ythdc1-cKO细胞启动了2C-like细胞程序，并在转录水平、MERVL报告系统、NANOG蛋白降解、胚胎嵌合等多个尺度证明Ythdc1-cKO细胞获得部分全能性的特征 （如可以形成CDX2阳性的滋养外胚层细胞） 。通过敲除后的回补实验，研究者发现YTH结构域的点突变就无法像野生型一样回复增殖抑制和2C-like转化的表型，从而证明Ythdc1-cKO细胞的这些功能表型是YTHDC1蛋白的m6A识别能力依赖的。
与此同时，研究者发现Ythdc1-cKO细胞的转录组中出现了明显的逆转录转座子激活（包括IAP、ERVK和LINE1） 。接着，通过YTHDC1-RIP实验发现YTHDC1结合这些转座子元件 （TE） 所转录出来的含m6A修饰的RNA。那么，YTHDC1结合这些TE来源的RNA行使了什么功能，能够使得这些TE在Ythdc1敲除时被激活？研究者之前发现过这部分TE是被SETDB1介导的H3K9me3所沉默的【8】，因此他们进行了H3K9me3的ChIP-seq并与Setdb1敲除的数据进行了比较，发现Ythdc1敲除会导致Setdb1依赖性的H3K9me3信号大幅度下降，而且SETDB1和YTHDC1存在蛋白相互作用，这些结果证明YTHDC1是SETDB1介导逆转录转座子沉默的重要机制环节，也揭示RNA m6A具有调控染色质的功能。
进一步的证据显示：YTHDC1确实结合在这些H3K9me3沉默的TE位点的染色质上，ChIRP-seq实验和GRID-seq数据的分析显示YTHDC1结合的IAP RNA和LINE1 RNA均有大量特异性的染色质结合，主要分布在相关的TE位点上。研究者将m6A的催化酶基因Mettl3敲除 （敲除外显子5-7，关键的MT-A70结构域从6号外显子开始） ，通过m6A-RIP确定mRNA和TE-RNA上的m6A修饰都基本去除。Mettl3-KO细胞也呈现出逆转录转座元件激活、H3K9me3下降的现象，结合前面提到的YTH结构域突变的回补实验，可以确定YTHDC1-SETDB1的染色质调控机制是m6A依赖性的。在探索逆转录转座子元件抑制与2C-like转化之间的关系时，研究者发现LINE1 RNA除了97%以上结合在LINE1的染色质区域上之外，也特异性结合并抑制Dux区域。Dux是2C-like转化的主导因子，敲除Dux位点后细胞不会发生2C-like转化，但仍会发生逆转录转座子激活，说明TE的激活并非细胞状态转化的结果，而这一细胞命运变化是受YTHDC1-SETDB1的染色质调控机制所决定的。
在裂殖酵母、植物和部分低等动物中，都发现了依赖于转录生成的小RNA所介导的异染色质形成机制，被称为RNA-induced transcriptional silencing （RITS）【11】，但哺乳动物一直没有发现这一机制。然而，裂殖酵母中还存在一个抑制减数分裂相关染色质位点的异染色质形成机制，这个机制依赖于一个YTH蛋白Mmi1识别减数分裂相关mRNA上的DSR基序来起始【12】。可以发现，尽管裂殖酵母的Mmi1并不依赖m 6 A来启动异染色质建立，这一工作发现的机制和这一机制较为类似，为理解哺乳动物中RNA如何调控染色质做出重要启示，也推动RNA m6A修饰的生物学功能的进一步理解。
高等多细胞生物具有精密的个体发育过程，其中的细胞命运决定事件涉及到各种细胞类型特异的表观遗传状态的准确建立，像H3K9me3等这种重要的修饰，理解其调控的特异性和在不同细胞类型中的异质性，还需要长时间的研究探索。这个工作在哺乳动物中发现了RNA通过m6A修饰调控转座元件区域H3K9me3的新机制，为这个方向增添了思维方式。由于RNA和转录因子都有定位到特定染色质位点的能力，只要发育过程应用这一机制的RNA分子具有异质性，就可能在不同的细胞命运决定事件中发挥作用。在这套机制中，RNA修饰和其识别蛋白的相互作用是特异的，识别蛋白的敲除也不影响组蛋白甲基化酶SETDB1的蛋白完整性和表达量，可以排除非特异性结合RNA和RNA直接结合调控酶等模式在实验证明上的困难。
值得一提的是，上个月复旦大学的表观遗传团队也发表了题为METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells的论文 （详见BioArt报道：） ，从m6A甲基化酶METTL3入手发现了类似的机制。
中国科学院广州生物医药与健康研究院陈捷凯研究员为本论文通讯作者，博士研究生刘家栋、高铭蔚和生物岛实验室何江平副研究员为本论文的共同第一作者。该工作得到实验室其他成员和合作团队的大力支持。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03313-9
专家点评
曹晓风 院士（中科院遗传发育所）
表观遗传的互动：推动生命的有序变化
转座子是一类能够在基因组上移动的DNA 片段，是真核生物基因组的重要组成部分。转座子的跳跃和插入可以改变基因组序列，调控基因的表达，为物种进化提供原动力；而如果这些转座元件在基因组中“随意”移动则会造成大量遗传突变威胁生命安全，因而进化出了一系列调控机制以限制转座子的活动。转座子依照转座方式的不同可以分为不依赖于转录的DNA转座子和转录依赖的逆转座子，逆转座子在哺乳动物中含量最为丰富。逆转座子的表观遗传调控对小鼠胚胎干细胞的发育至关重要，通常大部分被组蛋白修饰如H3K9me3与DNA甲基化修饰所沉默。
m6A是真核生物RNA上最丰富的一种动态可逆的化学修饰，对RNA的加工、代谢及正常生理功能的发挥具有重要的调节作用。m6A修饰可以被甲基转移酶“Writers”催化、去甲基化酶“Easers”去除和被结合蛋白“Reader”识别。m6A修饰的研究方兴未艾，针对m6A修饰与其他表观修饰之间的“互动”研究也刚刚开始。美国芝加哥大学何川教授、中科院北京基因组研究所韩大力教授和同济大学高亚威教授合作通过在小鼠胚胎干细胞中敲除m6A甲基转移酶复合体成员METTL3或m6A结合蛋白YTHDC1，发现它们以一种m6A依赖的方式提高了染色质的开放状态并激活转录，揭示了m6A修饰与染色质状态、转录之间的关系【13】。法国巴黎居里研究所Deborah Bourc’his和Tomasz Chelmicki团队研究发现m6A甲基转移酶复合体成员METTL3、METTL14、WTAP和ZC3H13通过催化内源性逆转录病毒（endogenous retroviruses，ERVs）RNA的m6A修饰来招募m6A结合蛋白YTHDF2促进ERVs转录的mRNA降解，从而维护基因组稳定性【14】。复旦大学生物医学研究院沈宏杰青年研究员和牛津大学Ludwig肿瘤研究所Yang Shi教授团队的研究表明在小鼠胚胎干细胞中METTL3可以通过结合ERV中的IAPEz（intracisternal A-particles，IAP）转座子，招募催化H3K9me3的甲基转移酶复合物SETDB1/TRIM28维持IAPEz转座子上的异染色质状态，实现对IAPEz元件转录的抑制【15】。陈捷凯团队的最新研究则揭示了YTHDC1介导的m6A修饰识别在异染色质修饰状态的维持和逆转座子沉默中的重要调控功能。这些精彩的高水平的研究工作逐步开始揭开m6A调控染色质状态和逆转座子沉默的“面纱”，体现出生命体表达调控机制的复杂性，这些复杂的调控过程精细操纵着遗传信息的流动，精准推动着生命的有序变化。
陈捷凯团队在研究中首先证实了YTHDC1的缺失导致小鼠胚胎干细胞转化为类似2-细胞期的状态，表明YTHDC1对小鼠胚胎干细胞维持是必须的，并且其功能的发挥依赖于对m6A修饰的识别。YTHDC1可以偏好性结合在一些具有m6A修饰的逆转座子来源的转录本，此类逆转座子沉默的维持受到SETDB1介导的H3K9me3修饰的调控。进一步的研究发现YTHDC1可以通过具有m6A修饰的逆转座子RNA结合到染色质，并调控SETDB1依赖的H3K9me3修饰状态，从而最终维持对应逆转座子的沉默，实现了基因表达的精准调控，确保发育程序的有序进行。
简而言之，该研究揭示了m6A调控染色质修饰水平与维持转座子沉默状态的新机制，系统验证了其在小鼠胚胎干细胞维持中的生物学功能，更新了人们对胚胎干细胞命运决定机制的认知，毫无疑问为该领域的重大发现与突破。此外，该研究也为揭示m6A在植物体内特别是作物中的功能提供了很好的借鉴。
专家点评
杨运桂 研究员（国家生物信息中心）
自芝加哥大学何川教授2011年发现FTO可以动态调控RNA m6A修饰以来，m6A这一在mRNA和ncRNA上存在的丰富修饰被发现参与诸多重要生理过程，形成了表观转录组学的新领域。m6A的特异性识别YTH蛋白 （reader） 中，YTHDC1因为分布在细胞核，也被称为m6A核内阅读器。我的团队与何川团队分别发现了YTHDC1参与调控mRNA剪接 （Xiao et al.Mol Cell, 2016） 和出核 (Roundtree et al.eLife, 2017) 过程，以及何川合作团队发现了敲除Mettl3或Ythdc1会导致染色质开放 （Liu et al.Science, 2020，详见BioArt此前的报道：） 。陈捷凯课题组发表的上述工作，发现YTHDC1也可以作为一个桥梁分子，介导RNA m6A启动组蛋白H3K9三甲基化和染色质的沉默。在小鼠胚胎干细胞中，这一机制介导了IAP/ERVK/LINE1等转座元件的沉默，还调控了全能性和多能性的细胞命运转化，Ythdc1或Mettl3敲除后会诱导2C-like细胞产生。近期沈宏杰/施扬合作团队也报道了METTL3调控IAP区域的异染色质形成 （Xu et al.Nature, 2021） 。这两项独立工作在分子和生化机制上互相支持，也形成互补。这项成果揭示了m6A调控染色质的新功能，对理解m6A的生理功能、染色质调控、干细胞干性调控有新的启发。
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参考文献
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