责编 | 酶美
肝脏是人体的一个重要器官，主要负责解毒、消化、蛋白合成和能量代谢等过程。人们很早就发现肝脏有惊人的再生能力，然而，究竟哪些细胞在肝脏的正常维持及损伤修复中发挥重要作用，却一直存在争议。从结构上看，肝脏由上千个称为肝小叶 （liver lobules） 的重复单元构成。每个肝小叶的横截面为蜂窝状六边形，六边形中心为中央静脉，顶点为三联管构成的门管区。三联管由小叶间静脉，小叶间动脉及小叶间胆管组成。小叶间静脉连接消化道，主要负责向肝运送各类营养物质。而小叶间动脉则负责从心脏向肝脏输送氧气。小叶间动脉及小叶间静脉的血液丛门管区流入肝脏后，在小叶内一些称为肝血窦的毛细血管中汇集并流入中央静脉最后汇入下腔静脉。肝血窦的周围，充斥着大量肝细胞及少量的巨噬细胞及星状细胞等。胆管负责收集由肝细胞合成并从肝细胞间隙流出的胆汁，最后汇入胆囊或者十二指肠。随着血液的流动，营养物质和氧气不断被肝细胞吸收，于是形成了从门管区到中央静脉区的梯度环境，这决定了对氧气需要不等的代谢过程在小叶内部呈现不对称分布。因此，我们能观察到肝小叶不同位置的肝细胞表达不同水平的代谢相关基因。根据代谢功能的不同，从门管区到中央静脉，每个小叶大致可分成第一、第二和第三区域 (zone 1, zone 2 and zone 3) 。十年来，关于三个区域的肝细胞是否具有相同的再生能力，还没有定论。
关于肝脏再生，Michael Karin研究组发现肝小叶第一区域少部分肝细胞能被Sox9标记的细胞，并在损伤修复中起重要作用 【1】 。而 Roel Nusse研究组发现，第三区域中央静脉周围有少量的Axin2阳性细胞, 在肝稳态维持中不断分裂产生新细胞并向其它区域扩张 【2】 。但这一结果在不久前，受到了来自于Jan S. Tchorz研究组的挑战， 他们用细菌人工染色体 （Bacterial Artificial Chromosome） 构建了一个新的Axin2-CreER 转基因小鼠，该转基因不破坏内源 Axin2 基因的表达, 结果显示Axin2阳性细胞在稳态条件下，基本不扩增 【3】 。此外， Steven E. Artandi 研究团队发现，零星分布于整个肝小叶的Tert高表达的细胞，无论在稳态还是在损伤修复中，都能够大量扩增并覆盖肝小叶的大部分区域 【4】 。最后，Holger Willenbring研究团队用腺相关病毒 （adeno-associated virus，AAV） 随机零星标记不同的细胞，发现肝小叶不存在增殖能力更强特殊细胞群，不同区域的肝细胞都有不同程度的增殖 【5】 。由于这些相互矛盾的结论是对不同的单一细胞标记的小鼠进行追踪而得到，没法排除其他未标记细胞是否也对肝再生有贡献。加上实验条件的不同，我们无法对这些结果进行比较分析并得出一个清晰结论（）。
2021年2月26号，德克萨斯州立大学西南医学中心儿童研究所Hao Zhu研究组在Science杂志上发表了题为Liver homeostasis is maintained by midlobular zone 2 hepatocytes的研究文章 （Research Article） ：揭示了肝小叶第二区域（zone2）的肝细胞是肝脏稳态维持和损伤修复中的主要细胞来源。该研究不仅回答了肝脏的基本生物学问题，且有助于我们理解脂肪肝，酒精性肝损伤和肝癌等慢性肝疾病的病变过程。
此前由于缺少能够标记肝小叶不同细胞类型的工具鼠，人们很难全面评估肝脏不同细胞群的再生能力。Zhu研究组的研究人员利用CRISPR-Cas9技术，将IRES-CreERT2整合到不同肝区域特异基因的3’-非翻译区，从而构建了11种标记肝小叶不同区域的转基因小鼠。该研究组还从Jackson Laboratory引入了3种已有的CreER小鼠，其中包括特异标记胆管上皮细胞的Krt19-CreER小鼠。接着，研究人员将这些小鼠与tdTomato荧光转基因报告小鼠杂交，得到的子代小鼠用Tamoxifen激活红色荧光蛋白的表达，结果显示：肝小叶的每个区域的肝细胞及胆管内皮细胞，至少能被两种转基因小鼠标记。于是，研究组以前所未有的规模同步追踪这14群细胞在一年内不同时间点的增殖或消亡情况，比较分析发现：在稳态条件下，小叶中心区域的肝细胞不断分裂产生新的细胞，而第一区域和第三区域的部分细胞则逐渐消亡。为了排除该结果与小鼠转基因有关，研究人员还用低剂量腺相关病毒（AAV）对少部分肝细胞进行随机标记和追踪，结果仍然支持肝小叶中心区域增殖更快的结论。进一步分析显示：新生细胞并非来源于数目极少的干细胞，而是来自于第二区域中的一组频繁出现的成熟肝细胞。为了充分验证这些结果，研究人利用能够在DNA复制时候整合到基因组的胸腺核苷酸类似物EdU进行细胞测试，结果证实发生增殖的细胞更多位于小叶中心区域。另外，Zhu研究组还用模仿普通肝毒性的化学物质开展了肝损伤修复实验，结果表明：第二区域的肝细胞能够免受损伤并补充到小叶的其它受损区域。
为了找到第二区域细胞扩增的主要调控机制。研究人员首先进行对整肝进行单细胞测序和分析，也从发表的文献中挖掘数据【6】(Ben-Moshe et al. 2019)，最终筛选到两组肝小叶中心区域特异的基因：一组在中心区域富集，另一组在中心区域降低或缺失。接着，研究人员利用CRISPR-Cas9系统进行了一系列包括基因敲除或激活的筛选实验。最后分析发现，Ccnd1是中心小叶增殖的一个重要基因。有趣的是，免疫组化结果显示，CCND1在肝小叶中心区域特异表达。接着，研究人员通过包括Western blot在内的实验发现，IGFBP2通过激活mTOR通路调节CCND1在小叶第二区域的表达，从而调控肝小叶中心区域细胞的增殖。在小鼠中抑制或者敲除IGFBP2-mTOR-CCND1通路的任一组分，都能够有效抑制第二区域新生细胞的产生。
总之，该研究发现了稳态情况下，增殖的肝细胞主要来源于肝小叶第二区域，这一过程受IGFBP2-mTOR-CCND1信号通路的调控。这不仅回答了肝脏生物学中的一个基本问题，也为理解肝病的发生和发展提供了有益的参考。
该研究由西南医学中心儿童研究所Hao Zhu研究组及其他合作者共同完成。韦永龙博士为本文的第一作者。西南医学中心的儿科、内科副教授，西南医学中心Kern Wildenthal, M.D., Ph.D. 杰出教授，德克萨斯州癌症预防和研究所（CPRIT）的癌症专家Hao Zhu 博士为本文的通讯作者。
值得一提的是，同期Science杂志还发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组的研究成果 （详见BioArt今日头条报道）Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair。该研究首次开发了能够长时程示踪体内细胞增殖的新技术，利用该技术研究人员发现了成体肝细胞的来源，为肝脏再生及肝疾病临床治疗研究提供了新思路。Science杂志还评论文章highlight了上述工作。
目前，Hao Zhu研究组正在招聘博后，有意者请邮件咨询hao.zhu@utsouthwestern.edu。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/371/6532/eabb1625；
https://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.abc4346
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参考文献
1. Font-Burgada, J., S. Shalapour, S. Ramaswamy, B. Hsueh, D. Rossell, A. Umemura, K. Taniguchi, H. Nakagawa, M. A. Valasek, L. Ye, J. L. Kopp, M. Sander, H. Carter, K. Deisseroth, I. M. Verma and M. Karin (2015). "Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer." Cell 162(4): 766-779.
2. Wang, B., L. Zhao, M. Fish, C. Y. Logan and R. Nusse (2015). "Self-renewing diploid Axin2(+) cells fuel homeostatic renewal of the liver." Nature 524(7564): 180-185.
3. Sun, T., M. Pikiolek, V. Orsini, S. Bergling, S. Holwerda, L. Morelli, P. S. Hoppe, L. Planas-Paz, Y. Yang, H. Ruffner, T. Bouwmeester, F. Lohmann, L. M. Terracciano, G. Roma, F. Cong and J. S. Tchorz (2019). "AXIN2(+) Pericentral Hepatocytes Have Limited Contributions to Liver Homeostasis and Regeneration." Cell Stem Cell.
4. Lin, S., E. M. Nascimento, C. R. Gajera, L. Chen, P. Neuhofer, A. Garbuzov, S. Wang and S. E. Artandi (2018). "Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury." Nature 556(7700): 244-248.
5. Chen, F., R. J. Jimenez, K. Sharma, H. Y. Luu, B. Y. Hsu, A. Ravindranathan, B. A. Stohr and H. Willenbring (2019). "Broad Distribution of Hepatocyte Proliferation in Liver Homeostasis and Regeneration." Cell Stem Cell.
6. Ben-Moshe, S., Y. Shapira, A. E. Moor, R. Manco, T. Veg, K. Bahar Halpern and S. Itzkovitz (2019). "Spatial sorting enables comprehensive characterization of liver zonation." Nat Metab 1(9): 899-911.