新冠疫情目前仍在全球肆虐，截止至2021年1月16日，新冠疫情在全世界已经造成了超过200万的死亡病例，新冠病毒的防控防治依然是目前世界公共卫生安全的头号问题。作为目前疫情防控的最重要手段之一，新冠病毒疫苗的研发备受全世界的关注。据统计，全球在研的新冠疫苗超过300项，其中进入临床应用的疫苗主要为技术相对成熟的灭活病毒疫苗和较新兴的病毒载体疫苗和核酸疫苗。随着重组蛋白技术的成熟，亚单位蛋白疫苗在疫苗研发中的价值越来越受到肯定，其直接以重组表达的抗原形式刺激免疫系统，在安全性、制备流程和免疫效果上都有着自身独特的优势。
刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）作为新冠病毒重要的表面糖蛋白，通过直接结合人的血管紧张素转化酶-2（ACE2）受体介导病毒粘附和细胞融合。其中S蛋白受体结合域（RBD）是直接结合ACE2的关键区域，阻断其与受体的结合能够显著抑制病毒的感染效率，因此也被认为是最具有价值的疫苗靶点之一。但是由于S蛋白的RBD单体刺激免疫反应的能力较弱，使用RBD单体作为抗原难以产生足够的保护性抗体，因此如何在不增加疫苗生产复杂性和保持蛋白高度稳定性的前提下增强RBD的免疫效果、提高其刺激机体产生保护性抗体的能力成为了开发RBD疫苗的重要问题。
针对这一难题，近日，中山大学肿瘤防治中心曾木圣教授课题组与广州医科大学赵金存教授课题组、广东省疾病预防控制中心柯昌文调研员课题组合作在ACS NANO杂志上发表了题为Rapid Development of SARS-CoV‑2 Spike Protein Receptor-Binding Domain Self-Assembled Nanoparticle Vaccine Candidates（基于SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域的自组装纳米颗粒候选疫苗的快速研发）的文章，设计了多个基于SpyTag-SpyCatcher共价蛋白偶联系统的纳米颗粒化RBD疫苗，并通过动物实验验证其免疫效果。
该研究在设计上使用了三种不同大小的纳米颗粒作为骨架，包括正八面体的24聚体铁蛋白（Ferritin）、正十二面体的60聚体mi3纳米颗粒蛋白（mi3）和正二十面体的120聚体I53-50纳米颗粒蛋白（I53-50），利用SpyTag-SpyCatcher形成的酰胺键，将RBD分别与这三种纳米颗粒蛋白在体外孵育，使RBD蛋白偶联到这三种不同纳米颗粒的表面。设计的三种RBD偶联的纳米颗粒疫苗不仅维持了RBD的空间构象，而且显著增强蛋白稳定性并增强其抗原性。这些特性赋予了这三种RBD偶联的自组装纳米颗粒更强的免疫效果，其诱导的保护效果最高可以超过单体RBD抗原 120倍。
蛋白表达方面，针对目前重组表达融合蛋白的不确定性，研究人员使用了两种不同的表达系统，在HEK293F真核表达系统中表达RBD-SpyTag蛋白，在大肠杆菌原核表达系统中表达融合了SpyCatcher的铁蛋白、mi3以及I53-50自组装纳米颗粒。随后将RBD与三种纳米颗粒在体外进行共价偶联，并且通过分子排阻色谱（SEC）进一步纯化以获得稳定的RBD偶联纳米颗粒，后续通过动态光散射（DLS）以及差示荧光扫描（DSF）检测纳米颗粒的均一性和稳定性。
RBD偶联纳米颗粒的组装和鉴定
在验证了纳米颗粒的物理和化学特征可靠性后，研究人员进一步评估其抗原性与RBD单体的差异。通过ELISA和动力学检测，结果显示，与RBD单体相比，RBD偶联的纳米颗粒能够显著提高与受体ACE2以及中和性抗体CB6的亲和力，且随着纳米颗粒的粒径增加，其结合能力增强，这些结果均高度提示纳米颗粒化对新冠病毒S蛋白的RBD区域具有重要的免疫增强效果。
小鼠免疫血清的抗体滴度以及血清竞争ACE2和CB6结合RBD的结果
随后研究人员在BALB/c小鼠中进行了动物免疫实验，将含有5μg等质量RBD的RBD单体以及三种不同的RBD偶联纳米颗粒与AddaVax或Sigma佐剂系统混合后免疫小鼠，结果显示，相比单体RBD，纳米颗粒能够显著诱导更高滴度的针对RBD的抗体，并且通过三个独立的病毒中和实验（SARS-CoV-2假病毒中和实验，SARS-CoV-2活病毒噬斑减少中和实验以及SARS-CoV-2活病毒细胞病变中和实验）证实了纳米颗粒能够显著提高中和抗体的滴度，最高可达单体RBD的120倍。为了解释该现象，研究人员使用了生物膜层干涉（BLI）技术对小鼠血清/单体RBD进行了竞争结合ACE2的实验，发现接种了RBD偶联纳米颗粒组的小鼠血清相比单体RBD能够显著抑制受体ACE2结合RBD的能力，高度提示免疫了RBD共轭纳米颗粒之后诱导的抗体能够更好地中和病毒表面的RBD从而减少其结合ACE2并感染的几率。
小鼠免疫血清的中和实验结果，三个纳米颗粒免疫组均显示远优于单体RBD的免疫效果
综上所述，此项研究开发了三种不同的RBD偶联的纳米颗粒蛋白，其免疫效果相比单体的RBD具有显著提升，并且利用两套不同的表达系统，大大提高了制备RBD纳米颗粒的便利性和可拓展性，研究所提出的三种纳米颗粒骨架蛋白未来可进一步用于其他病原体疫苗的开发，不仅为新冠病毒疫苗的研究提供了新思路，也为预防其他病原体的纳米颗粒蛋白疫苗设计提供了重要的平台。
中山大学肿瘤防治中心曾木圣教授、广州医科大学赵金存教授、广东省疾病预防控制中心柯昌文调研员和中山大学肿瘤防治中心冯国开助理研究员为本文的共同通讯作者，中山大学肿瘤防治中心康银峰博士后、2018级博士研究生孙聪、广州医科大学庄珍博士和广东省疾病预防控制中心袁润余副研究员为本文的共同第一作者。
https://dx.doi.org/10.1021/acsnano.0c08379