导语
细胞生活在不断变化的复杂环境中，通过信号转导通路传递外部的信号和刺激到细胞内的调控网络。2021年1月7日，北京大学物理学院/定量生物学中心李方廷、欧阳颀生物物理团队与北大数学学院李铁军课题组以及中国农业大学楼慧强课题组合作，在Physical Review X杂志发表名为“Stochasticity triggers activation of the S-phase checkpoint pathway in budding yeast”的文章，通过酵母菌的单细胞时序数据，提供了噪声驱动细胞在不同状态之间跳转的直接证据，揭示了噪声在信号转导通路中的重要作用。
高鑫| 作者
邓一雪| 编辑
论文题目： Stochasticity triggers activation of the S-phase checkpoint pathway in budding yeast 论文地址： https://journals.aps.org/prx/abstract/10.1103/PhysRevX.11.011004
进入21世纪，由于微流控技术和荧光蛋白表达技术的发展，细胞内随机性的定量研究成为研究热点。2002年 M. Elowitz 等人首先在大肠杆菌中观察到并描述了基因表达中的随机性。这一研究在随后得到拓展，2004年 J. Raser 等人在酵母菌中分析了噪声在染色体重塑相关基因表达过程的作用。关于细胞内不同状态跳转的定量描述，则在2005年由M. Acar等首先完成，他们在群体水平计算了噪声驱动的细胞状态跳转速率与势垒的关系。随着单细胞观测技术的成熟，2008年 P. Choi 等人通过单细胞成像观察到了细胞内不同状态之间的跳转。但是，在单细胞水平对细胞内不同状态之间跳转行为的定量描述仍然不全面，对于噪声在信号转导过程中的作用和对细胞状态的影响，人们还缺乏直接的实验证据和定量的研究。
为了研究噪声在细胞信号转导通路中的作用，研究者选择真核细胞芽殖酵母（S. cerevisiae）的S期检查点通路的激活过程作为研究对象，通过不同突变株在不同外界刺激强度下，单细胞水平时间序列数据的分析，揭示了噪声在细胞信号转导通路中的动力学机理（图1）。
图1 噪声驱动的细胞不同状态的跳转过程。通过分析单个酵母细胞DNA复制检查点激活过程的时间序列数据，发现了从未激活的Off状态到激活的On状态的跳转过程，得到了对应的双峰分布及跳转速率。基于随机过程主方程模型，提出激活过程为正反馈引起的双势阱随机跳转过程，很好地拟合了不同酵母突变菌株在不同刺激强度下的跳转速率。
在真核细胞的细胞周期过程中，S期（DNA合成期）检查点的功能对于修复复制过程的DNA损伤、维护遗传物质完整性有极其重要的作用。芽殖酵母的S期检查点与哺乳动物和人类高度相似。当酵母细胞受到化学药物羟基尿（HU）介导的DNA复制压力刺激时，S期检查点的关键激酶Rad53将被磷酸化，检查点的激活过程被启动，转录生成下游蛋白Rnr3，并进行单链DNA的修复过程（图2）。该过程中Rnr3蛋白将增长上百倍。
图2 酵母细胞细胞周期过程中的S期检查点通路
研究者首先在Rnr3蛋白后标记了绿色荧光蛋白作为报告信号，通过微流控和单细胞成像技术获取Rnr3荧光蛋白的时序数据，希望通过Rnr3蛋白的时序数据的分析，研究单细胞内激酶Rad53的磷酸化过程。其次，对原始荧光蛋白时序数据，通过求微分可以得到荧光蛋白的变化率（FGR），以及在0~t时间内的最大荧光变化率（MFGR）。某个细胞在0~t时间内的MFGR描述了该细胞在0~t时间内是否被激活过。在HU的作用下，观察MFGR的时序变化，可以发现单个细胞表现为从Off态到On态的跳转，S期检查点激活过程存在着激活态（On态）和未激活态（Off态）两种状态。进一步的分析表明，细胞群体在Off态的跳转等待时间呈指数分布，可以求出细胞从Off态到On态的跳转速率；对于不同浓度的HU刺激，细胞表现出了不同的跳转速率；跳转速率与刺激强度（HU的浓度）正相关（图3）。为了改变Rad53激酶的自磷酸化强度，研究者还构建了不同的Rad53激酶突变菌株，发现其在Off态的跳转等待时间也符合指数分布，相应的跳转速率也发生了变化（图4）。
图3 (a) 酵母野生菌株的不同细胞的原始荧光时序数据、FGR和MFGR时序图。(b) 在药物的不同浓度刺激下，酵母细胞从未激活的Off态向激活的On态的转变过程。
图 4 两种酵母突变菌株中Off态细胞比例随时间的变化结果
为了解释了上述的双峰分布和Off态等待时间的指数分布实验结果，研究者分别构建了确定性动力学的常微分方程（ODE）和随机动力学的主方程模型，并拟合了不同浓度HU刺激下不同的突变菌的跳转速率（图5）。研究结果表明酵母检查点激活过程是噪声驱动的双势阱之间的“barrier-crossing”过程，单个细胞的状态由噪声驱动从Off状态跳转到On态，其中DNA损伤强度信号（HU浓度）和Rad53激酶的正反馈（Rad53的自磷酸化强度）共同决定了双势阱之间的势垒高度和跳转过程的速率。
图5 随机动力学的双势阱模型解释并拟合了不同基因突变菌株在不同刺激强度下S期检查点从Off态到On态跳转速率的实验结果
这一工作不仅在单细胞水平上提供了噪声驱动细胞不同状态转换的直接证据，而且发展了通过单细胞蛋白表达时序数据得到细胞不同状态转化速率的方法，即由原始荧光，求微分得到FGR，再求最大值得到MFGR的单细胞分析方法。这一通过单细胞转录蛋白表达数据得到上游通路中关键激酶活化水平的分析方法，也适用于其他单细胞水平的实验和分析。
考虑单个细胞内的基本信号转导通路过程，研究者的研究结果还表明，对于大肠杆菌和酵母菌这类细胞体积比较小，细胞内某一类关键激酶蛋白数目在几百到两三千之间，那么在信号转导通路中噪声的影响比较大。这种情况类似于酵母细胞S期检验点激活过程中的双势阱体系，噪声会起到重要的作用，需要利用随机动力学模型来描述。但是，对于体积较大的哺乳类细胞，尤其是人类体细胞，由于单个细胞中某一类蛋白或者激酶的数目在几千到上万的水平，所以信号转导通路中的噪声效应就比较小，可以用确定性的常微分方程来描述。
北京大学李方廷、李铁军和中国农业大学楼慧强为共同通讯作者。北京大学周沛劼、高鑫和中国农业大学李晓丽为共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京智源人工智能研究院等机构的支持。
参考文献
Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., & Swain, P. S. (2002). Stochastic gene expression in a single cell. Science, 297(5584), 1183-1186.
Raser, J. M., & O'Shea, E. K. (2004). Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. science, 304(5678), 1811-1814.
Acar, M., Becskei, A., & van Oudenaarden, A. (2005). Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature, 435(7039), 228-232.
Choi, P. J., Cai, L., Frieda, K., & Xie, X. S. (2008). A stochastic single-molecule event triggers phenotype switching of a bacterial cell. Science, 322(5900), 442-446.