靶向序列捕获联合高通量测序鉴定成人型多囊肾PKD1基因新突变
沙艳伟
厦门大学附属妇女儿童医院/福建省厦门市妇幼保健院男科
常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)是最常见的遗传性肾脏疾病,患者多在成年后发病,群体中发病率为1/1000[1]。ADPKD是由蛋白激酶D1(PKD1)(约85%的病例)或蛋白激酶D2(PKD2)(约15%的病例)突变引起的[2]。PKD1基因定位于16号染色体的短臂上(16p13.3),由51个外显子组成。cD-NA编码区是由12912个核苷酸(NM_001009944.2)组成,并编码4303个氨基酸[3]。
PKD1基因编码的多囊蛋白-1(PC1)水平降低可导致ADPKD的临床特征[4]。囊肿的发生和扩大是由于管状细胞增殖和凋亡之间的平衡紊乱、膜蛋白细胞极性的改变、细胞外基质缺陷、异常的液体分泌和纤毛功能异常引起的,从而导致肾脏增大、间质纤维化[5]。本研究采用高通量靶向基因捕获测序发现PKD1基因新剪切位点突变,通过家系病史和文献分析,确定PKD1突变为致病基因,现报道如下。
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资料与方法
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1.1一般资料
收集1个ADPKD家系(图1)。先证者(Ⅱ1),女,36岁,结婚10年,因其“多囊肾”避孕至今未生育,2019年3月就诊于本科室进行生殖遗传咨询。超声检查提示:肾脏超声可见双肾体积及形态正常,肾实质内出现无数个大小不一的无回声区(图1),最大的为1.6cm×1.3cm,集合系统未见异常。先证者父亲因多囊肾导致肾衰竭、尿毒症,已去世。本研究经医院伦理委员会审批通过,患者及家属均已签署知情同意书,在本院行靶向序列捕获联合高通量测序,并进行基因检测和分析。
图1 患者家系图 图2 患者肾脏超声图
1.2方法
1.2.1DNA提取 抽取受试者及对照者静脉血2mL,按照试剂盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit,Qiagen,Hilden,德国)流程提取基因组DNA。
1.2.2目标序列捕获与测序 利用CovarisLE220超声波仪(Massachusetts,美国)将基因组DNA打断成200~250bp的片段,随后进行Ampure Beads纯化,将纯化后的DNA片段进行末端修复、加“A”以及加接头反应,从而完成单个患者的DNA建库。
Non-Captured样品进行连接介导PCR(LM-PCR),纯化,利用定制的基因片段捕获芯片(Roche Nimble Gen,Madison,USA),与10~20个标记好的患者DNA库47℃杂交64~72h,杂交结束后进行芯片的洗涤和洗脱反应,随后进行Captured样品的LM-PCR反应。
文库经Agilent 2100 Bio analyzer和ABI Step One进行片段大小、浓度、富集度的检测,最后利用高通量测序仪Illumina HiSeq2500 Analyzers(Illumina,SanDi-ego,USA)连续双向测序90个循环,用Illumina Pipeline software(version1.3.4)读出原始测序数据[6]。
1.2.3序列分析 数据下机后进入信息分析部分。首先对下机的原始数据(rawreads)进行测序质量评估,去除低质量以及被接头污染的reads。随后用BWA软件(Burrows Wheeler Aligner)[7]与HG19进行序列比对,与此同时进行序列捕获效果评价,用SOAPsnp[8]软件和Samtools[9]软件分别进行单核苷酸变异(SNV)和插入缺失(Indel)的查询,生成目标区域碱基多态性结果,随后进行数据库(NCBI dbSNP Hap Map,1000 human genome data set和data base of 100 Chinese healthy adults)的比对,并对找出的可疑突变进行注释、筛选[6]。
1.2.4 Sanger测序 对于所发现的致病突变,在其所在片段上、下游设计引物,进行PCR扩增,对产物做Sanger测序,所得结果与PKD1基因标准序列GRCh37/hg19进行比对,从而验证基因芯片捕获和高通量测序的结果。
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结果
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2.1基因测序结果 先证者(Ⅱ1)血标本行PKD1、PKD2和多囊性肝肾疾病1(PKHD1)基因的全部外显子、外显子与内含子交界区行靶向捕获及高通量测序,结果为先证者PKD1基因存在剪切位点突变,即c.12138+1G>A杂合突变(图3)。因其父亲因多囊肾去世,无法验证,其母亲未见PKD1基因上存在c.12138+1G>A杂合突变,与Sanger测序验证结果一致,同时查阅人类基因突变数据库专业版及特异性位点突变数据库未见PKD1基因上存在c.12138+1G>A杂合突变。
2.2突变致病性分析
通过在ExAC数据库中搜索c.12138+1G>A位点的等位基因频率,笔者发现该位点变异的频率极低,为0.000008689,因此该位点是极为罕见的突变位点,也暗示其致病性。
该剪接位点突变可能引起两种剪接改变,第一种由于c.12138+1G>A位点突变后,其所在的内含子无法被剪接,因此该段内含子保留下来,使得c.12138之后的序列导致移码,形成新蛋白p.Leu4047Valfs*179;第二种可能的剪接方式为将c.12138+1G>A位点旁的外显子与该位点所在的内含子一起被当作内含子剪接下来,导致c.12004_12138del;p.4002_4046del。因此无论采取哪种剪接方式,均会对PKD1蛋白的功能造成严重影响。
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讨论
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ADPKD的临床特征是在肾脏中形成并生长出充满液体的囊肿,这些囊肿压迫邻近的肾小管,导致肾损伤和纤维化。ADPKD致病基因有PKD1、PKD2和PKD3。
本研究对先证者进行这3个基因的测序检测,发现PKD1基因存在c.12138+1G>A剪切突变,该突变位点目前尚未见报道。该位点在健康人群中突变概率极低。ADPKD的分子机制较为复杂,涉及多种信号通路失调和多种细胞过程的畸变,包括细胞增殖、液体分泌增加、细胞凋亡和肾小管上皮细胞不完全分化等[8]。
PC1是由PKD1编码的大蛋白质,具有多个跨膜结构域,以及细胞外区域,提示细胞-细胞或细胞-基质中的相互作用,细胞内结构域提示信号转导中的作用,并且可与多囊蛋白-2(PC2)相互作用。PC2相对分子质量较小,具有跨膜结构域,可作为具有钙通透性的阳离子通道,并可调节PC1,这些蛋白质及与囊性肾病相关的许多其他蛋白质均定位于原始纤毛,这充当了肾脏中的流量传感器作用[9];大多数纤毛相关基因突变会导致肾囊性疾病[10]。
有研究显示初级纤毛由Hedgehog(Hh)介导信号传导,其以组织依赖性方式调节细胞增殖和分化[11]。在规范的途径中,Hh配体与纤毛上Hh受体蛋白Patched-1(PTCH1)结合,激活Smoothened(SMO)信号传感器,该信号最终转导到胶质瘤(GLI)信号转录因子的下游,该转录的中介体也调节纤毛[12]。
纤毛的形成依赖于一种纤毛特有的纤毛内转运蛋白(IFT)运输系统,IFT复合体沿着纤毛的轴丝双向运动,运输纤毛形成和维持所需要的物质,在小鼠模型中,大多数IFT-B蛋白的丢失导致纤毛缺失或发育迟缓和无法应答Hh信号[10]。相反,IFT-A蛋白缺失,导致在纤毛的远端末端球状结构中的蛋白质累积和增强Hh通路的激活[13-14]。
在肾脏或胚胎发育晚期中IFT-B或A基因缺失会导致肾囊肿[15]。PKD1基因突变导致的多囊肾为常染色体显性遗传,患者生育后代有50%的概率遗传并致病,如本例患者生育可选择产前诊断或植入前遗传学诊断预防后代发生多囊肾。
综上所述,PKD1是导致ADPKD的常见基因,其致病机制较为复杂,本研究报道了一个PKD1新剪切突变位点,为ADPKD诊疗提供理论依据。
参考文献：
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文章来源：《检验医学与临床》杂志
编辑：姜旭
审阅：管佩钰