天文二十二年（1553年），在武田家的庇护之下得以恢复旧领的真田幸纲（即真田幸隆实名）将三子送往踯躅崎馆处出仕武田信玄，这个名为出仕实则担任人质的真田家之子便是后来大名鼎鼎的真田昌幸。
真田昌幸出仕武田信玄之后，迅速成为有着“甲斐之虎”之称的武田信玄的亲信，与曾根昌世、土屋昌续、三枝昌贞、三枝新十郎、曾根与市之助等五人一同成为武田信玄最亲近的侧近，负责监视并评判家臣、浪人的工作。
永禄四年（1561年），因为桶狭间之战发生的连锁反应，上杉谦信对北条家、武田家发起了侵攻，武田信玄与上杉谦信在川中岛爆发了“第四次川中岛合战”。在此战之中，真田昌幸作为武田信玄的近习众出阵，据说这也是他的初阵。
真田昌幸身为真田家的三子，原本是无论如何也没有真田家的继承权的。不过，武田信玄非常欣赏真田昌幸的才华，便让他继承了甲斐国的名门武藤氏，真田昌幸的名字由真田源五郎改为了武藤喜兵卫。武藤喜兵卫与曾根昌世活跃于武田家的当主武田信玄的两侧，二人被武田信玄称为“我的双眼”，真田昌幸在担任武田信玄侧近期间，虽然没有机会领着军队出战，但是也耳濡目染了武田信玄的兵法与战阵，收益颇多。然而很快地，真田昌幸的人生就发生了巨大的变化。
元龟四年（1573年），武田信玄在西进攻打德川家的途中旧病复发，于回国途中病逝，几个月之后，真田家的中兴之主真田幸纲也撒手随武田信玄而去。
武田家的新任家督为武田信玄四子武田胜赖，《甲阳军鉴》里称其只是家督阵代，而他的儿子才是武田家的家督，这其实是《甲阳军鉴》里的捏造。实际上，当年各地大名均给武田胜赖送去了继承家督的祝贺信，庆祝其继承了武田家的家督之位，并且武田家为了稳定领内，向外宣称武田信玄因病隐居退位，没有公开武田信玄的死讯。
天正三年（1575年），武田胜赖发兵一万五千人西进，继续武田信玄吞并德川家的战略，武田军兵分两路，一路由武田胜赖亲自率领，从骏河国杀入远江国，佯装攻打奥三河地域，而别动队则攻入三河国，试图与德川家的家臣大冈弥四郎里应外合夺下冈崎城。然而，大冈弥四郎的谋叛被同僚举报，遭到逮捕，武田胜赖不得不与别动队会和，继续攻打奥三河的城池，在连下数城之后，武田胜赖来到了长筱城下，“长筱·设乐原合战”就此阴差阳错地爆发了。
得知武田军再度西进，织田信长率领了三万人的援军来到了战场，随军携带了三千五百余挺铁炮，越过了设乐原，来到了位于设乐原边上的小河连吾川，并沿着河岸布下了马防栅，以阻挡武田军的进攻。
武田胜赖轻敌冒进，明知织田·德川联军在河对岸布阵，却依然在长筱城留下了四千人后，率领着一万一千人朝着连吾川前进，与织田·德川联军对峙。没曾想，在武田军进军以后，包围长筱城的武田军被酒井忠次率领的别动队奇袭，瞬间崩溃，武田胜赖的后路被断，为了防止被敌人夹击，武田胜赖不得已向着联军发起进攻。
现代再现的设乐原古战场马防栅
然而武田军要渡河进攻，谈何容易，再加上联军早有准备，在河岸布满了阻挡进攻的马防栅，并在马防栅后布下了铁炮队与弓队，最终济河而进的武田军在连吾川留下了两千多具尸体，小幡信真率领的赤备骑马队也损失过半。真田昌幸的两个哥哥真田信纲、真田昌辉也在连吾川战场之上，真田队与马场队一起位于武田军的右翼，原本只是负责牵制联军左翼的织田军，然而在武田军左翼、中部的四波攻击遭到挫败以后，真田队与马场队朝着织田军发起了最后一波进攻。
武田胜赖轻敌冒进，被迫向着联军发起进攻，但是他并没有战死沙场的决心，在第五波进攻也被挫败以后，武田军立即转入守势，武田信丰、小山田信茂队迅速将阵地转移到了武田胜赖本阵之前，以护卫当主。武田胜赖在得到喘息之后，丢下了军队独自逃走，武田信丰等人见武田胜赖逃走之后，便带着几个部下一同护卫武田胜赖脱离战场。
为了掩护家主突围，武田军进行了长达两个小时的惨烈的殿后作战，下午三时左右，武田胜赖已经逃走，武田军彻底崩溃，遭到前后夹击的武田军陷入了绝境，几乎没有突围的希望，山县昌景、马场信房、内藤昌丰以及真田兄弟等数十名家臣均在被追击的过程中战死。
武田家的红莲之梦，就此落幕。战后，武田家因为战死的中上级家臣过多，竟然出现了城代稀缺的情况，武田胜赖不得不命武藤喜兵卫恢复本姓，继承了真田家，真田昌幸这才作为真田家的家督登上了舞台。
天正十年（1582年），武田信玄的女婿木曾义昌叛变，织田信长发起了规模浩大的“甲州征伐”，长筱合战以后日薄西山的武田家被摧枯拉朽一般平推。武田胜赖在新府城召开军议，真田昌幸提议武田胜赖放弃新府城，前往真田领内的上野国岩柜城，岩柜城地势险要，且离盟友上杉家距离较近，或可求得一些援军，再次，也可逃往越后国依附上杉家。小山田信茂则提议前往自己的领地岩殿城，岩殿城也是一座坚城，织田军人数众多，后勤压力巨大，只要在岩殿城撑过一波攻击，静候织田军粮尽退兵即可。武田胜赖的儿子武田信胜则更是威武，直接提出在新府城召集残军与织田军决战，绝对不能丢武田家的脸。
武田信胜的提议固然不可取，毕竟留得青山在不愁没柴烧，剩下的便是真田昌幸与小山田信茂的建议了。不过，武田胜赖的近臣长坂钓闲斋则向武田胜赖表示，真田家不过是一介侍大将而已，成为武田家的家臣并不久，不足以信赖，应该前往出仕了武田三代的小山田信茂的领地方才安全。
武田胜赖犹豫了之后，决定前往岩殿城，而真田昌幸也与武田胜赖分别，前往上野国的岩柜城布防，离别之时，真田昌幸提议让武田信丰前往信浓国小诸城防守，待织田军从信浓国杀入甲斐国以后，信浓、上野的武田军可合兵攻打织田军的后方。当然，这个计划最终也没有实现。
天正十年（1582年）三月十一日，武田胜赖在前往小山田信茂领地途中得知小山田信茂叛变，又遭到泷川一益率领的织田军的攻击，于天目山自尽，平安时代以来的甲斐源氏名门武田家灭亡。
得知武田胜赖自尽以后，真田昌幸放声大哭，仰天长叹，并扬言要聚兵攻打小山田氏复仇。然而此时的情况，真田家尚且自身难保，又如何能够复仇呢？在真田昌幸的眼中，真田家的主公已然不在了，接下来他要做的，便是在乱世之中保存真田家。
在武田胜赖死前，真田昌幸便已经同北条家进行交涉，究竟是因为识时务想背叛武田家，还是迈出“表里比兴”的第一步，不得而知。武田家灭亡后，织田军继续进军上野国，上野国的武田领地望风而降，真田昌幸也立即放弃同北条家的交涉，转而投靠了织田信长，成为织田军在上野的新参众。真田昌幸的及时站队，一度让他产生了真田家稳了的错觉。
真田昌幸
当年六月，织田信长在本能寺之变中身亡，织田家在武田遗领的家臣们或死或逃，尤其是甲斐国爆发了大规模的武田旧臣一揆，甲斐这块地几百年都是姓武田的，再加上织田信长对武田遗族与旧臣相当刻薄，此时墙倒众人推也不足为奇。
武田遗领周围，除了织田家本身内乱以外，德川、上杉、北条纷纷发兵侵攻武田家的旧领，此时面对三个强敌的真田昌幸所有的领地，分别信浓国的小县郡、上野国的吾妻郡、利根郡三个郡，还并非全境。真田昌幸先是投靠了上杉家，随后在北条军侵入信浓国以后，又转而投靠了北条家，最终又在德川家康的调略之下投入了德川家。
而德川家康在与北条氏政争夺武田遗领之后，最终也因为德川家兵力不足、北条家余力不足而和谈，而和谈的条件之一，便是将真田昌幸在上野国的沼田领割让给北条家。
真田昌幸会同意吗？当然不会，实际上，真田昌幸一直在利用德川家康，他借口信浓国有针对德川家的叛乱，获取德川家的援军，取得了户石城等要害，后来又以防守上杉家为名，让德川家支援修筑了坚城上田城。
天正十三年（1585年），因为北条家催促德川家，德川家催促真田家转交沼田领，真田昌幸再度投靠了上杉家，德川家康愤而发兵信浓，攻打真田昌幸，第一次上田城合战爆发。在这一战中，真田昌幸以寡兵击退了德川家康，并且为了让上杉景胜安心（之前有背叛上杉家前科），真田昌幸将次子真田信繁（真田幸村）送往上杉家作为人质，同时还与羽柴秀吉接触，希望能够直接臣从羽柴秀吉。
天正十五年（1587年），在羽柴秀吉基本上控制了织田军的旧领后，真田昌幸前往大坂城觐见羽柴秀吉，正式成为羽柴秀吉的家臣，在羽柴秀吉的命令之下，真田昌幸作为骑寄前往骏河国出仕德川家康，成为德川家康的与力。真田昌幸获得了独立大名的地位，之前出仕上杉景胜的次子真田信繁出仕了羽柴秀吉，而他的长子真田信幸则出仕了德川家康。
真田兄弟的分裂，从此时开始便是命中注定的了。
天正十八年（1590年），因为沼田领的争端，北条家擅自出兵攻打了名胡桃城，导致了“小田原征伐”的发生。丰臣秀吉派出大军攻打关东的超级大名北条家，真田家也作为丰臣家的家臣出兵关东，并在战后获得了十万石的加封。
然而，此时的真田家领地分别位于上野国与信浓国，沼田领与上田领之间将近隔了一百公里左右，支配不便。因此真田昌幸便将沼田领交与真田信幸，令其以沼田城城主的名义支配上野的真田领地，真田昌幸自己则以上田城城主的身份统治信浓国的真田领。
此时真田信幸虽然得到父亲的信赖，得以统治沼田领，但是其继承人之位却受到了严重的威胁。真田昌幸的次子真田信繁出仕了丰臣秀吉以后，非常受宠，在真田信幸续任从五位下伊豆守官途的同时，真田信繁也续任了从五位下左卫门佐的官途。并且真田信繁的妻子还是丰臣秀吉宠信的侧近大谷吉继的女儿。相比之下，真田信幸迎娶了德川家重臣本多忠胜的女儿，得到了德川家的支持，兄弟二人之间的裂痕，因此变得更大了。
庆长五年（1600年），丰臣家陷入了战乱——“关原合战”。在前年丰臣秀吉死后，丰臣家的重臣前田利家也相继病死，丰臣秀吉临终前计划的大坂之前田利家—伏见之德川家康的互相制衡计划失去了平衡，德川家一家独大。
上杉景胜在领内违规招募兵马，修筑城池，德川家康作为丰臣家的重臣，在大坂城的支持下出征上杉家的会津领地。而石田三成、毛利辉元等人因不满德川家康独大，在德川家康东进以后，掀起了叛乱，石田三成作为区区一个隐居的奉行，却擅自向原本要随德川家康出征上杉家的丰臣大名允诺巨大的领地。
真田信幸（黙れ！）
真田昌幸在此时也收到了石田三成的书信，石田三成向真田昌幸保证，只要真田家加入己方，甲斐、信浓二国的领地便任由其攻略，打下多少算多少。真田昌幸与次子真田信繁加入了西军，而长子真田信幸则跟着岳父加入了东军。事后通常说真田昌幸为了保存真田家因此才将兄弟二人拆分为东西军，这样无论哪方胜了，真田家都能够存续下来。实际上并没有那么复杂，真田信幸背后的支持者一直都是德川家，其与父亲分道扬镳加入德川家一点也不奇怪，而真田信繁则作为大谷吉继的女婿，只得加入西军。
真田昌幸的算盘打的很好，德川家康因为要对付石田三成，必然不会前来攻打上田城，趁着德川家西进的档口，真田昌幸可以施尽自己的战争天赋，攻略下甲信并非痴人说梦。在关原合战的大背景下，第二次上田城合战爆发。
此时真田昌幸手上军队约三千余人，而德川秀忠则率领着三万八千人。真田昌幸与初次上阵的德川家康三子德川秀忠于上田城对阵，多次击败了德川军的进攻，反之，真田军在真田昌幸的指挥下，竟然各种伏击、奇袭德川军，使得德川秀忠陷入苦战。最终，德川秀忠不得不放弃攻打上田城，在留下军队看守上田城后，继续进军美浓国，试图与德川家康的大军会合。
令真田昌幸没有想到的是，决定天下归属的关原合战仅仅在一天之内就结束了。小早川秀秋暗通东军，于开战之际突然率军攻向西军，石田三成布置在松尾山附近监视小早川秀秋的胁坂安治等人也跟着小早川秀秋叛变，歼灭了西军右翼的大谷吉继队，随后又相继击破西军中部与左翼。
战后，石田三成等西军要犯被斩首，真田昌幸得知西军战败后，便决意与德川家康决一死战，相继击破了几队上田城下的德川军。然而此时的真田昌幸已经是强弩之末了，在真田信幸的劝降下，真田昌幸只得向德川家康投降。德川家康原本想对真田昌幸与真田信繁处刑，但是真田信幸多方运作，借助本多正信与本多忠胜之手向德川家康说尽了好话，父子才得以免死，被流放至高野山山麓的九度山拘禁。
在高野山隐居的期间，真田昌幸与真田信繁的生活异常贫瘠，多亏了真田信幸每年都向父亲和弟弟送去生活费。而真田昌幸也多次向德川家康表示自己的悔过之心，希望能够得到原谅，让他返回领地。然而，德川家康对这个让自己吃尽苦头的真田昌幸恨意十足，尤其是真田昌幸竟然借德川家之手修筑了上田城并反过来针对德川家的这种行为恨得牙齿痒痒，真田昌幸到死都没有能离开九度山。
庆长十六年（1611年），真田昌幸逝世，享年六十五岁。临终前真田昌幸对真田信繁留下遗言，认为旧公仪丰臣家与新公仪德川家必有一战，若真有那天，真田信繁定要加入丰臣家消灭德川家。同时，真田昌幸还托付给真田信繁遗计说，若两家交战，定要向丰臣家建议以攻为守的战略，迅速出兵占领美浓国、尾张国，隔断中山道、东海道与京畿的联系，等候德川军的到来。在德川军到来之后可以退守近江国，护卫住京畿的大门，与德川军对峙，等候根基不稳的德川军内部的变数，最次也可以与德川家划日本而治。
真田信繁（幸村）
然而，真田昌幸的一厢情愿并没能够实现，从未作为大将领军的真田信繁并不受到丰臣家的重视与信任，同时缺乏领军经验的真田信繁也未必能够像从小就在武田信玄身边学习信玄韬略的真田昌幸一样有能力统率大军出战。
庆长十九年（1614年）至庆长二十年（1615年）的大坂之阵中，真田信繁作为丰臣家的大将活跃于大坂城的战场之上。然而此时丰臣家大势已去，最终真田信繁也没能够实现父亲消灭德川家的遗愿，战死在了大坂城下，丰臣家也就此灭亡。
元和八年（1622年），真田信之（真田信幸改名）从上田领转封至同在信浓国的松代领，成为信浓国领地最大的松代藩的初代藩主。真田家在真田信之的统治下得以续存，真田信之本人也特别能活，直到九十三岁才寿终正寝。