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细胞中的RNA可以以一百多种不同的方式被化学修饰，这些修饰与众多的细胞功能息息相关。每种RNA修饰都需要其特异的调控因子，包括修饰酶、去修饰酶和识别蛋白。但是，相较于日新月异的RNA修饰检测技术，系统性鉴定RNA修饰调控因子的方法仍然相当有限。大多数修饰酶的鉴定是通过体外的酶活实验，或通过已有的结构信息分析而得。例如，第一个m6A甲基转移酶METTL3，是通过一系列体外生化实验（包括传统色谱技术、凝胶电泳和微测序）鉴定所得【1,2】；通过基于METTL3的系统性进化分析，科学家成功发现m6A甲基转移酶复合物的另一关键蛋白，METTL14【3】。总的来讲，第一种研究手段效率相对较低，而第二种研究方法则依赖于相关分子的先验知识。到目前为止，仍缺乏高通量筛选新型RNA修饰调控因子的系统性手段。
近日，南方科技大学陈炜课题组在Molecular Systems Biology上发表了CIGAR-seq, a CRISPR/Cas-based method for unbiased screening of novel mRNA modification regulators的研究。该研究报道了一种名为CIGAR-seq的实验技术，该技术首次融合了高通量CRISPR基因筛选技术和一种以mRNA修饰为信号的报告基因系统。该方法将gRNA和mRNA修饰位点进行偶连，通过同时读取mRNA修饰比例和gRNA序列，使得针对mRNA修饰调控因子的高通量筛选成为可能。该文以mRNA的m5C修饰展示了CIGAR-seq的高效应用。
由于先前研究指出，细胞内除NSUN2以外，还潜在含有另一种甲基转移酶负责mRNA的m5C修饰【4,5】。作者首先对HAP1细胞内NSUN2非依赖的m5C位点进行了鉴定，并选取位于FURIN基因3’UTR上的m5C位点建立了报告系统，而后针对细胞内800多种RNA结合蛋白进行了CRISPR筛选。筛选发现了一种全新的mRNA m5C甲基转移酶，NSUN6。通过建立NSUN2和NSUN6的敲除细胞系和mRNA-BisSeq，作者发现NSUN6和NSUN2负责了几乎所有mRNA的m5C修饰，并描述了NSUN6和NSUN2所修饰位点的序列特征。与此同时，NSUN6作为全新的mRNA m5C甲基转移酶也被国际上其他两个实验室独立发现【6,7】。
此外，作者不仅通过实验证实CIGAR-seq可被用于鉴定介导RNA m1A修饰的甲基转移酶及其辅助因子，还指出该方法可用于其它多种mRNA修饰、编辑、以及转录后调控机制相关因子的筛选和鉴定，为mRNA转录后调控相关因子的系统性研究提供了一个新的重要工具。
南方科技大学生命科学学院生物系陈炜教授、副研究员方亮为本文的共同通讯作者，方亮、博士研究生王雯、副研究员李贵鹏为本文的并列第一作者。陈炜课题组链接：http://chenlab.bio.sustech.edu.cn/
原文链接：
https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/msb.202010025
参考文献
1.Bokar, J.A., et al., Characterization and partial purification of mRNA N6-adenosine methyltransferase from HeLa cell nuclei. Internal mRNA methylation requires a multisubunit complex. J Biol Chem, 1994. 269(26): p. 17697-704.
2.Bokar, J.A., et al., Purification and cDNA cloning of the AdoMet-binding subunit of the human mRNA (N6-adenosine)-methyltransferase. RNA, 1997. 3(11): p. 1233-47.
3.Wang, Y., et al., N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nat Cell Biol, 2014. 16(2): p. 191-8.
4.Huang, T., et al., Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nat Struct Mol Biol, 2019. 26(5): p. 380-388.
5.Trixl, L. and A. Lusser, Getting a hold on cytosine methylation in mRNA. Nat Struct Mol Biol, 2019. 26(5): p. 339-340.
6.Liu, J., et al., Sequence- and structure-selective mRNA m5C methylation by NSUN6 in animals. National Science Review, 2020.
7.Selmi, T., et al., Sequence- and structure-specific cytosine-5 mRNA methylation by NSUN6. bioRxiv, 2020.