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【科研摘要】

再生医学应用定制合成水凝胶的常用方法包括掺入RGD细胞粘附肽,但是在纳米级评估对工程微环境的细胞反应仍然具有挑战性。迄今为止,尚无研究证明水凝胶中RGD的浓度如何影响单个细胞表面受体的表达。11月,帝国理工学院Molly Steven教授团队通过关联宏观和纳米尺度的单细胞界面定量技术研究了人类间充质干细胞(hMSCs)和RGD功能化的聚(乙二醇)水凝胶之间的相互作用。相关论文题为Nanoscale Molecular Quantification of Stem Cell–Hydrogel Interactions发表在《ACS Nano》上。作者使用单细胞原子力光谱法对合成水凝胶上的RGD解除结合力进行了定量,揭示了hMSC的短期结合对RGD浓度敏感。还进行了直接随机光学重建显微镜(dSTORM)来量化整联蛋白α5β1与生物材料之间的分子相互作用,出乎意料地揭示出,整联蛋白在水凝胶-细胞界面处的聚集增加与可用的RGD结合位点较少相关。该定量方法揭示了对特定干细胞-水凝胶相互作用的机理见解,其中dSTORM对整联蛋白α5β1的细胞表面定位中RGD依赖的差异提供了纳米灵敏度。研究结果发现,有可能精确确定肽官能化的水凝胶如何在分子水平上与细胞相互作用,从而为微调生物活性配体的空间表现提供基础。

【图文解析】

1.水凝胶的制备和技术开发

的技术方法,使用了与hMSCs相连的RGD肽功能化水凝胶作为模型系统。将基于8臂,20 000 Da的PEG-降冰片烯的聚乙二醇(PEG)水凝胶与不同浓度的共价连接的线性细胞粘附RGD肽(CGGRGDSP)进行光交联,其中存在RGD序列在纤连蛋白和一些其他细胞外基质蛋白中,它们结合了几种细胞表面受体,尤其是整联蛋白α5β1。整合素结合的RGDSP基序以前曾用于促进细胞与基于PEG的水凝胶的附着,并且发现PEG水凝胶中的束缚RGD肽对于封装的hMSC生存是必需的。由于其线性,因此作者选择使用线性RGDSP肽与大多数形式的环状RGD相比,对整合素α5β1的结合亲和力更高。基于PEG的硫醇-降冰片烯“ photoclick”水凝胶提供了一种高度通用且受良好控制的平台来探测细胞与材料的相互作用。在光引发剂和紫外光的存在下,将8臂PEG大分子单体与不可降解PEG-1000二硫醇接头和拴系的RGD肽以2:1接头:肽的摩尔比交联成网络(图1a)。

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图1.干细胞-水凝胶界面示意图。

SCFS是一种原子力显微镜(AFM)技术,可提供分子对单细胞与材料相互作用的洞察力.SCFS以前仅在少数研究中用于测量单细胞与材料之间的解键力,以鉴定分子相互作用并阐明初始粘附机制,但据悉,尚未将这种凝胶用于具有特定的细胞-粘合剂相互作用的水凝胶。它是表征细胞表面相互作用的有价值的工具,具有高度敏感但可测量的力范围很广(10-100 nN),并且具有精确的空间和时间控制。在作者的实验装置中,单个hMSC被粘附到功能化的AFM悬臂和与水凝胶接触(图1b)。撤回与hMSC绑定的悬臂后,可以精确地测量单个解离事件。 hMSCs悬臂的连接是由伴刀豆球蛋白-A细胞膜糖蛋白相互作用介导的(图1c)。通常,dSTORM是在非常薄的样品上进行的,但是在此,作者将介绍一种适用的设置,该设置可使dSTORM在与水凝胶相互作用的细胞上成像。通过对倒置的水凝胶成像并将激光聚焦在界面膜上,分析了与RGD水凝胶接触的hMSC表面上RGD结合细胞表面受体整联蛋白α5β1的可用性(图1d)。

2.RGD可用性决定了hMSC在肽功能化水凝胶上迁移。

hMSC在体内的关键作用是其迁移到损伤部位的能力。该迁移受hMSC与其底物的粘附影响。观察与高和低RGD水凝胶结合的hMSC,发现细胞形态受到RGD量的显着影响,在100%RGD上表现出更广泛的形态,在10%RGD上表现出纺锤形(图2a)。接下来,作者表征单个hMSC的迁移,以确定RGD细胞粘附肽的浓度是否对细胞的宏观行为有影响。在6小时内进行了实时荧光成像(图2b),发现在高结合力和低结合水凝胶上的hMSCs没有显示出方向性偏好(图2c)。有趣的是,与100%RGD水凝胶上的1.7μm/ min相比,在10%RGD水凝胶上的hMSC在水凝胶表面的移动速度更快,中位速度为2.6μm/ min(图2d)。此外,在10%RGD水凝胶上的hMSC迁移更远,中位位移为488μm,而在100%RGD水凝胶上则为314μm(图2e)。这些实验证明并证实了RGD肽的可用性影响形态和迁移行为。

图2. hMSC在RGD水凝胶上的迁移分析。

3.使用单细胞力谱图绘制hMSC-RGD解键力

SCFS用于研究RGD浓度对hMSC与水凝胶之间粘附力的影响,从而提供分子水平的见解来解释迁移速度的差异。在SCFS测量过程中,可以将悬臂挠度(力)的变化测量为将细胞拉开并与水凝胶完全分离(图3a)。在这里,作者已经量化了hMSC和水凝胶之间相对于RGD浓度的纳米级和皮秒级粘附力。首先,对在变化的RGD浓度的水凝胶上的回缩曲线下的面积(图3a中标注的蓝色区域)进行积分,从而量化了将hMSC与水凝胶完全分离所需的粘附能(图3b)。在hMSC与水凝胶相互作用的力-距离曲线中,观察到典型的破裂事件(图3A,插图框),特别是力阶跃(或“跳跃”),之后是力的斜坡状变化。对全部破裂事件进行了量化(图3c),并且将高斯拟合应用于高达200 pN的力分布。对单个破裂事件的进一步分析表明,SCFS对水凝胶中RGD的可用性敏感。对于100%RGD水凝胶,在单次力距曲线中检测到的总破裂事件(NT)的平均数(图3d)几乎是10%RGD水凝胶的NT的两倍(178%)。

图3.从水凝胶表面分离的hMSC的单细胞力光谱。

4.使用dSTORM表征整联蛋白α5β1hMSC表面聚类

作者着手量化粘附在RGD功能化水凝胶上的hMSC质膜表面上α5β1整合素的数量和排列。在它们的活性,扩展构象中进行免疫标记α5β1整联蛋白可以评估整联蛋白与配体结合的表面可用性(图4a)。与100%RGD水凝胶相比,含10%RGD水凝胶的细胞-材料界面处的α5β1利用率显着增加(图4b)。使用聚类分析算法Clus-DoC基于噪声的应用程序的基于密度的集成空间聚类(DBSCAN)功能,(50)识别出α5β1聚类,并在感兴趣区域(ROI)内生成了聚类图及其密度 为4×4μm(图4c和d)。通过对簇的分析,作者发现,相对于100%的水凝胶,10%的水凝胶表面定位的中位数显着增加了232%,簇的数目增加了363%,簇的密度增加了363%(图4e)。

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图4.整联蛋白α5β1的dSTORM成像。

5.总结

为了探索多尺度接口测量之间的相关关系,作者在0和1之间建立了索引(图5)。虽然该索引简化了细胞与材料相互作用的复杂性,但它使细胞粘附和跨多个长度尺度迁移的各种细胞过程得以比较和组合。并排绘制这些索引值揭示了未结合事件和受体定位之间的明显差异,这有助于解释宏观细胞迁移的观察结果。在高结合(100%RGD)水凝胶上,hMSC和RGD之间的强相互作用(以更高数量的RGD-hMSC脱结合事件为例)说明了细胞对基底的稳定粘附和较慢的迁移。在低结合(10%RGD)水凝胶上,hMSC与水凝胶之间较少的特异性相互作用,如减少的RGD-hMSC未结合事件所示,与增加的α5β1表面定位和聚集相关,可能是细胞反应,试图改善细胞黏附,导致更快的迁移。

图5.多尺度接口参数的相关性。

参考文献:

doi.org/10.1021/acsnano.0c07428

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