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真核细胞前体mRNA需要经过复杂的加工过程才能成熟，进而行使其生物学功能。前体mRNA的加工过程包括：5’末端加帽，内含子与外显子的剪接，以及3’末端加工。mRNA 3’末端的加工包括切割和多聚腺苷化两个步骤 (cleavage and polyadenylation, C/P)：具有内切核酸酶活性的蛋白因子能够识别前体mRNA 3’非翻译区 (3’ untranslated region, 3’ UTR)中的多聚腺苷信号(poly(A) signal, PAS), 进而发生切割；随后，多聚腺苷聚合酶(poly(A) polymerase, PAP)在切割位点后添加多聚腺苷尾 (poly(A) tail)。在哺乳动物细胞中，前体mRNA 3’末端加工机器的核心蛋白因子多达20多种，他们与RNA聚合酶II形成复合体，该复合体可进一步划分为4种亚复合体，包括：切割和多聚腺苷酸化特异性因子、切割刺激因子、切割因子Ⅰ和切割因子Ⅱ；以及其他因子包括 poly(A)聚合酶、poly(A)结合蛋白等。前体mRNA 3’末端的切割和多聚腺苷化两个步骤协同进行，作为重要的转录后修饰手段对前体mRNA的成熟，细胞核输出以及后续生物学功能的实现至关重要【1】。
多聚腺苷信号(poly(A) signal, PAS)在前体mRNA中广泛存在，选择性切割和多聚腺苷化(alternative cleavage and polyadenylation, APA) 可产生具有不同长度3' UTR的mRNA异构体，还可以改变基因的编码区。在过去的十几年的研究中，我们已经了解到APA在细胞增殖，分化，肿瘤的发生等过程中扮演重要的角色；不同组织中mRNA异构体 3' UTR的长度具有显著性差异 （例如：神经组织中mRNA异构体倾向于具有较长的3' UTR，而卵巢、睾丸、骨骼、肌肉等组织中mRNA异构体具有相对较短的3' UTR）；这一现象在果蝇，小鼠，以及人体中被广泛发现，但调控该组织/细胞特异性APA的分子机制尚不清晰【2】。
近日，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC)的Eric Lai实验室在Molecular Cell杂志发表了文章Overlapping Activities of ELAV/Hu Family RNA Binding Proteins Specify the Extended Neuronal 3’ UTR Landscape in Drosophila, 该研究以果蝇神经系统为研究对象，发现了一类神经系统特异性RNA结合蛋白，ELAV/Hu家族蛋白，能够调控果蝇神经系统中前体mRNA的选择性切割和多聚腺苷化过程，作者提出了三种ELAV/Hu家族蛋白具有可以互相补充的调控组织特异性APA的活性。该研究首次确认了果蝇神经系统中调控APA的反式调节元件(trans-acting factors)，并进一步阐释了ELAV/Hu家族蛋白调控神经系统APA的分子机制。
追溯到2012年，作者所在的Eric Lai实验室在Cell Report上发表Global patterns of tissue-specific alternative polyadenylation in Drosophila首次系统地描述了果蝇中广泛存在的组织特异性APA现象，提出神经系统中mRNA异构体具有较长的3‘ UTR这一特征【3】；随后，利用该实验室开发的mRNA 3’末端高通量测序技术，他们发现果蝇组织特异性APA现象在不同果蝇种系中具有高度的保守性【4】，但分子机制未知。ELAV/Hu家族RNA结合蛋白是一类神经特异性表达的RNA结合蛋白，该家族包括Elav蛋白及其同源的Rbp9蛋白和Fne蛋白。Elav蛋白(embryonic lethal abnormal vision)特异性地表达于果蝇神经细胞中，长久以来被作为神经细胞marker而广泛使用；Elav蛋白对于果蝇早期胚胎发育，神经系统发育具有重要作用。Elav基因突变果蝇死于早期胚胎发育时期。Rbp9蛋白和Fne蛋白同样也在神经系统中特异性表达(Rbp9蛋白在卵巢中也有一定水平的表达)，对于Rbp9蛋白和Fne蛋白功能的研究相对较少，因为其基因突变果蝇几乎没有明显表型(某些Rbp9蛋白突变会造成雌性果蝇不育)。
2012年，UC Berkeley Michael Levine实验室报道了Elav蛋白调控果蝇胚胎组织特异性APA的初步结果，确认了果蝇胚胎中APA过程单独依赖于Elav蛋白的表达【5】。作者实验室对这一结论持怀疑态度，首先，作者发现Elav基因突变果蝇并非立即死于胚胎时期，而是能够发育至第一幼虫阶段(1st stage larvae, L1)。通过收集Elav基因突变果蝇晚期胚胎并使其继续发育至第一幼虫阶段，手动去除卵壳，能够得到存活的Elav基因突变型第一阶段幼虫，并解剖出其中枢神经系统(central neural system, CNS)。RT-qPCR 验证一些基因的APA，作者惊讶地发现，虽然Elav蛋白并不表达，但是选取的基因仍旧表达3’ UTR较长的mRNA异构体，这与2012年Michael Levine实验室的结论不相符。作者提出假设，在Elav突变的情况下，其他ELAV/Hu家族成员可能存在补偿效应，继续调控神经系统中APA以表达3’ UTR较长的mRNA异构体。
接下来，利用gain-of-function体系，作者在果蝇晚期胚胎细胞系(非神经细胞系)中过表达单独的ELAV/Hu家族RNA结合蛋白，发现每一种ELAV/Hu家族RNA结合蛋白都能够独立地调控APA，使细胞表达3’ UTR较长的mRNA异构体；通过mRNA 3‘末端高通量测序技术发现，在非神经果蝇细胞系中过表达ELAV/Hu家族RNA结合蛋白会引起广泛地APA调控使得细胞表达具有较长3’ UTR的mRNA异构体，其3’ UTR长度与果蝇神经细胞中检测到的3’ UTR长度相符。这些结果从一个方面印证了Rbp9蛋白和Fne蛋白也具有和Elav蛋白相同的调控神经特异性APA的功能；在非神经细胞中过表达ELAV/Hu家族RNA结合蛋白，会调控非神经细胞具有神经细胞相似的转录组特征。
令人好奇的是，果蝇神经系统在正常生理情况下，Elav蛋白主要表达在细胞核中，但Rbp9蛋白和Fne蛋白主要表达在细胞质中，APA发生在转录后修饰阶段，前体mRNA仍存在于细胞核中，所以Rbp9蛋白和Fne蛋白基本不可能转移到细胞核中调控APA。通过对Elav突变的第一阶段幼虫中枢神经系统的染色结果分析，作者发现当Elav蛋白由于突变不表达时，通常位于细胞质中的Fne蛋白转移进入了细胞核 (图1左)。这一重要发现为Fne蛋白能够补偿Elav蛋白缺失，进而调控神经系统APA提供了关键性证据。但是为什么在Elav蛋白突变时，Fne蛋白会转移到细胞核内呢？作者惊奇地发现，在Elav突变的第一阶段幼虫中枢神经系统中，fne转录本发生了选择性内含子/外显子剪接，一个未被注释的45 bp微小外显子被包括在新的fne转录本中，而这个微小外显子在正常生理情况下是不被包括在fne转录本中的 (图1右上)。该微小外显子编码15个氨基酸残基，位于Fne蛋白结构中的J6-J7区域，而该区域恰好被报道参与调控蛋白定位与迁移。作者进一步验证了在细胞水平，两种Fne蛋白（包括与不包括这个微小外显子编码的15个氨基酸残基）在细胞中的定位具有显著差异：不包括该15个氨基酸的Fne蛋白严格地定位于细胞质中；而包括了15个氨基酸的Fne蛋白显著性地定位于细胞核中 (图1右下)。该实验结果强有力地证明了当Elav蛋白突变后，fne转录本通过选择性剪接编码一个“新”的Fne蛋白，能够转移到细胞核中，代替Elav蛋白行使调控神经系统APA的功能。
图1：Elav蛋白与Fne蛋白在野生型和Elav蛋白突变果蝇的第一幼虫中枢神经系统的定位，以及Fne蛋白核转移的分子机制。
利用loss-of-function体系，作者进一步研究了Elav蛋白与Fne蛋白双突变果蝇，并发现该果蝇第一阶段幼虫中枢神经系统mRNA不再保有较长的3‘ UTR。进一步证实了Fne对于Elav的补偿效应。对于Rbp9，因其在果蝇第一阶段幼虫时期的表达量极低，作者猜测其并没有过多地在该发育阶段参与APA的调控。生物信息学研究表明，ELAV/Hu家族RNA结合蛋白偏好于结合3’ UTR中的U-rich区域，他们通过结合近端多聚腺苷信号(proximal PAS)下游的U-rich区域，阻碍3’末端加工机器识别proximal PAS，进而指导RNA聚合酶II继续转录生成较长的3‘ UTR区域，最终识别远端多聚腺苷信号(distal PAS), 使得神经系统中广泛地表达具有较长3’ UTR的mRNA异构体。具有较长3’ UTR的mRNA异构体同时具有重要的生物学功能，对于保有神经可塑性，轴突树突的神经活性具有重要的意义【6】。
与此同时，更进一步的研究正在进行，关于使用高通量测序技术系统性研究ELAV/Hu家族RNA结合蛋白在神经系统转录组中的结合位点；以及使用蛋白质组学的手段，探索ELAV/Hu家族RNA结合蛋白在不同细胞亚结构之间定位的变化所引起的蛋白-蛋白相互作用的差异。同时，将此研究结果延伸至哺乳动物细胞，探究哺乳动物中ELAV/Hu家族RNA结合蛋白对于神经系统APA的调控方式。
Eric Lai实验室的博士后魏绿为该论文的第一作者，博士后Seungjae Lee为并列第一作者，进行了生物信息学分析，博士后Binglong Zhang进行了果蝇解剖和染色工作。Sonali Majumdar，Brian Joseph，Piero Sanfilippo，Pedro Miura进行了一部分早期工作，Matthias Soller提供了转基因果蝇，Eric Lai为共同通讯作者。
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.09.007
制版人：嘉
1. Elkon, R., Ugalde, A. P., & Agami, R. (2013). Alternative cleavage and polyadenylation: extent, regulation and function.Nature Reviews Genetics. 14(7), 496-506.
2. Gruber, A.J., and Zavolan, M. (2019). Alternative cleavage and polyadenylation in health and disease.Nat Reviews Genetics. 20, 599–614.
3. Smibert, P., Miura, P., Westholm, J.O., Shenker, S., May, G., Duff, M.O., Zhang, D., Eads, B.D., Carlson, J., Brown, J.B., et al. (2012). Global patterns of tissue-specific alternative polyadenylation in Drosophila.Cell Rep. 1, 277–289.
4. Sanfilippo, P., Wen, J., and Lai, E.C. (2017b). Landscape and evolution of tissue-specific alternative polyadenylation across Drosophila species.Genome Biol. 18, 229.
5. Hilgers, V., Lemke, S.B., and Levine, M. (2012). ELAV mediates 3’ UTR extension in the Drosophila nervous system.Genes Dev. 26, 2259–2264.
6. Garaulet, D.L., Zhang, B., Wei, L., Li, E., and Lai, E.C. (2020a). miRNAs and Neural Alternative Polyadenylation Specify the Virgin Behavioral State. Dev.Cell54, 410–423.e4.