5 篇顶级报道，业界传奇冷冻电镜技术新突破，如今首次捕获生命的原子细节，获利的不仅仅是结构生物学...
l 看清原子，冷冻电镜开创新的篇章
冷冻电镜近年来在学术界可谓炙手火热，顶级 CNS 文章屡见不鲜，不断掀起结构生物学、药物研发等领域的认识革新。同时，它也开创了一项学术界传奇，那就是物理学家斩获诺贝尔化学奖，奖励他们帮助生物学家。
2017 年，诺贝尔化学奖被授予瑞士洛桑大学的 Jacques Dubochet、美国哥伦比亚大学的 Joachim Frank 和英国剑桥大学的 Richard Henderson，他们的获奖理由是「研发冷冻电子显微镜，用于测定溶液中生物大分子高分辨率结构」。
图片来源：诺奖官网
三年后，冷冻电镜技术完成了划时代的突破，首次达到了原子分辨率。即利用该技术能清楚地看见大分子量蛋白三维结构的原子种类和分布。
冷冻电镜技术的突破，将不仅仅在结构生物学引起一场风暴，也将对相关研究领域起到重要的推动作用。对于理解蛋白质催化的化学反应的机理以及研究药物如何结合和干扰蛋白质的功能至关重要，对基于结构的药物设计有画龙点睛之效。
2020 年 10 月 21 日，Nature「背靠背」在线发表了两篇文章，将人们利用冷冻电镜的观测精度扩展到了原子分辨率级别。
德国马普生物物理化学研究所结构动力学系 Holger Stark 课题组发表了题为 Breaking the next Cryo-EM resolution barrier – Atomic resolution determination of proteins! 的文章，实现了对去铁铁蛋白（apoferritin）结构在原子级别的分辨率（1.25）的解析。
图片来源：Nature
另一项研究则由英国医学研究委员会分子生物学实验室（MRC-LMB） 的结构生物学家 Sjors Scheres 和 Radu Aricescu 所领衔的团队完成，该团队在1.2 的分辨率上重建了小鼠去铁铁蛋白（mouse apoferritin）的结构。
Mark A. Herzik 在Nature发表题为 Cryo-electron microscopy reaches atomic resolution 的点评文章，进行了系统评述。此外Science也刊发了对这项技术进行了解读。
图片来源：Science
这同一天发表于 Nature 的两篇文章，充满着奇妙的缘分。Yip 和 Nakane 以及他们的合作伙伴们在这场技术革命中起到了居功至伟的作用，他们获得了分辨率高达 1.2 的脱铁铁蛋白结构，使蛋白质的单个原子可视化得以实现。而这项史无前例的壮举在十年前被认为是不可能被实现的。
在这可媲美 X 射线晶体衍射技术、高达 1.2 的分辨率加持下，该蛋白结构碳、氮、氧原子清晰可见，与蓝色的电子密度图得到了完美的契合。
完整的膜蛋白结晶，大而动态的复合物机器，使得冷冻电镜技术获得蛋白结构充满挑战。
Yip 和 Nakane 等人对冷冻电镜技术进行了革新，利用硬件升级、加速样品采集与改善样品质量相融合的方法，实现了冷冻 - EM 密度图质量的显著提高，为在常规小分子调节剂高通量筛选和基于结构的药物发现中常规应用 cryo-EM 提供了一条途径。
目前，这项技术只适用于异常坚硬的蛋白质（proteins that are unusually rigid） 。接下来，研究人员将努力用刚性较低的大型蛋白质复合物来达到类似的高分辨率，如剪接体。剪接体是一种大型的蛋白质和 RNA 分子复合物，它切断了 RNA 中命中要转化为蛋白质的「内含子」 。
Cryo–electron microscopy reveals the atomic details of apoferritin, a hollow, spherically shaped protein complex that stores iron.
图片来源：Science
l 冷冻电镜技术的前生今世
一直以来，核磁共振 （NMR） 光谱，X 射线晶体学和冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 作为结构生物学研究中的三大技术马车，为解析蛋白、核酸的结构，进而解释生物大分子的三维结构及其动态变化立下汗马功劳。
结构生物学起源于利用 X 射线晶体学获得第一个蛋白质结构血红蛋白和 DNA 双螺旋结构，且均荣膺诺贝尔奖，从此生命科学的研究正式进入分子生物学时代。数十年来，以结构生物学为依托发现的研究成果，像闪耀的明星，频频出现在诺贝尔奖项的舞台上。
诺贝尔奖台上的部分结构生物学相关成果
图片来源：作者自制总结
与核磁共振 （NMR） 光谱和 X 射线晶体学技术相比，cryo-EM 已成为确定大型动态复合物结构的关键技术，即在没有结晶的情况下确定生物大分子的原子结构，弥补了前者的技术瓶颈，使得解析高分辨率生物大分子复合物的三维结构变得更为容易和常规。
冷冻电镜单颗粒技术
图片来源：作者自制总结
1968 年，D.J. De Rosier 和 Aaron Klug 在Nature上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构 T4 噬菌体尾部三维结构的著名论文，Aaron Klug 本人于 1982 年获得诺贝尔化学奖。
1974 年，Kenneth A. Taylor 和 Robert M. Glaeser 于 1974 年提出了冷冻电镜技术，并且用于实验研究。
2013 年加州大学旧金山分校 (UCSF) 程亦凡和 David Julius 的研究组首次得到膜蛋白 TRPV1 的 3.4 近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在Nature上。这是一项具有里程碑意义的研究成果。
l冷冻电镜技术的丰硕成果
近年来，越来越多蛋白质或复合蛋白质结构解析领域被称为诺贝尔奖级别的论文陆续发表，背后的利器正是冷冻电镜。
进入 21 世纪后，利用冷冻电镜技术发表的文章呈现井喷式增长。2015 年，Nature 杂志旗下的子刊Nature method将冷冻电镜技术评为年度最受关注技术。
数据来源于 NCBI
图片来源：作者自制总结
冷冻电镜在技术层面的发展无疑是飞速的，也有越来越多的通过冷冻电镜技术得到的研究成果发表在高水平的期刊上。以世界著名结构生物学家施一公教授的课题组为例，近两年来利用冷冻电镜技术在国际顶尖期刊上发文章到手软，极大地推动了我国结构生物学学科的发展。
图片来源于文献
l冷冻电镜的美好前景
之前，冷冻电镜对更为复杂的结构并没有很好的处理方式，在一些分子量比较大，包含多层的病毒结构研究中，一直没有高分辨率的三维模型，使得科学家们对于病毒的认识受限。
然而随着冷冻电镜技术突飞猛进的发展，它开始在药物设计、疫苗开发领域大放异彩。由冷冻电镜技术解析的结构为复杂的生化过程的分子机理提供了前所未有的认知，对药物发现产生了深远的影响，通过结构推知功能，结合典型药物的作用方式和作用机制，定向设计和开发高度精准性的新药，达到精准治疗的目标。
2019 年，中国科学家利用冷冻电镜技术解析到世界上目前分辨率最高的猪瘟病毒结构，助力科研人员了解该病毒的发病机理、更好地开发疫苗，为我国养猪业和人民食品安全保驾护航。
图片来源于文献
冷冻电镜技术作为一门交叉学科，其技术突破必将给生物、物理、材料、精准医学等领域带来了一场大风暴，未来大有可为。
l 技术发展的背后，也面临重重难题
惊艳的技术背后，冷冻电镜技术仍然距离多数科研工作者比较遥远，距离「走入寻常百姓家」仍有距离。
1.制备高质量的的样本，即如何保证样品分子颗粒均一的分布在厚度恰当的玻璃态冰层中决定着实验结果的成败，例如膜蛋白的获取对结构解析起着关键作用；模型三维重构和优化、计算软件的更新换代需要分析人员扎实的理论基础；
2. 冷冻一般高端冷冻电镜价格都在 3000 万人民币以上，还不包括需要额外配备的近 400 万人民币的 K2 相机。且冷冻电镜一年的运行维护保养成本也有 300 万左右。电镜购买和操作成本，目前对于大多数机构来说都是遥不可及。
3.并不是回答每个生物学问题都需要利用到冷冻电镜技术，且该技术对目标蛋白的性质有要求，例如解析剪接体、蛋白 - RNA 复合物结构时难度较大，但技术革命可以限制大分子三维结构中的不准确性，并为理解生物学功能提供更好的平台。
如何使冷冻电镜技术走下云端，回到地面，适用于研究各种生物问题，我们需要走的路还很远。
参考资料：
1.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2829-0
2.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2833-4
3.https://www.nature.com/articles/d41586-020-02924-y
4.https://www.sciencemag.org/news/2020/10/cryo-electron-microscopy-breaks-atomic-resolution-barrier-last
5. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27238019/
6. doi:10.1126/science.abf3697
题图来源：Nature