撰文 | 静雪
责编 | 兮
Caspase-8通过死亡受体 (包括TNFR1和Fas) 介导细胞凋亡。Fas或Fas配体 (FasL) 的突变往往会引发T淋巴细胞的凋亡异常，从而导致人类自身免疫性淋巴增生综合征 (ALPS) 。相比之下，除了ALPS，Caspase-8或其接头FADD的突变可导致更复杂的疾病，包括对复发性病毒和细菌感染的易感性增加，以及非常早发病的炎症性肠病(VEO-IBD) 。
小鼠组织中FADD-或Caspase-8的缺失也会导致肠道炎症、对感染的易感性增加以及对TLR刺激的反应减弱。在某些条件下，TLR3和TLR4通过接头蛋白TRIF激活Caspase-8，但TLR3和TLR4信号通常不会导致细胞凋亡。但是，FADD-caspase-8缺失的促炎反应背后的潜在机制仍不明确。此外，Caspase-8的哪些底物对正常的TLR反应和先天免疫来说是至关重要的仍然是未解之谜。
近日，斯坦福大学医学院的Alexander D. Gitlin联合美国基因泰克公司的Vishva M. Dixit和Kim Newton在Nature上发表了一篇名为Integration of innate immune signaling by caspase-8 cleavage of N4BP1的文章，该研究发现N4BP1是细胞因子反应的有效抑制因子；N4BP1被Caspase-8切割是炎症过程中的信号整合点；并对FADD-caspase-8突变引起的免疫缺陷给出了解释。
为了确定TLR4信号传导过程中caspase-8的底物，在有或没有泛半胱天冬酶抑制剂emricasan的情况下，作者将未经处理的小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (BMDMs) 与用TLR4激动剂脂多糖(LPS) 刺激1小时的BMDMs进行比较。质谱分析显示，仅用LPS处理的两种最丰富的特异性肽来自NEDD4结合蛋白1 (N4BP1) (图1)。蛋白质印迹证实LPS处理30分钟内增加了约54 kDa N4BP1片段的水平，这与Asp488后的切割一致。
图1
考虑到TLR3和TLR4的刺激可以激活caspase-8，作者分别用Mlkl-/-Fadd-/-和Mlkl-/-caspase-8-/-BMDMs证实N4BP1的切割确实需要FADD和caspase-8。同时，自分泌TNF的产生似乎诱导了未刺激的野生型BMDMs中N4BP1的低水平切割。此外，表达催化失活的caspase-8 (C362A) 的Mlkl-/-Casp8C362A/C362A小鼠MEFs在接受LPS刺激时，N4BP1的切割受损。以上结果表明，FADD和caspase-8的催化活性对于LPS诱导的N4BP1切割是必需的。
作者还发现，仅依赖接头蛋白MyD88的TLRs (TRIF非依赖性TLR) 的激动剂，包括Pam3csk4 (TLR1/2激动剂)、R837 (TLR7激动剂) 或CpG-B DNA (TLR9激动剂) ，在刺激1小时内都无法诱导出可检测的N4BP1切割。作者还发现，Trif-/- BMDMs细胞可响应TNF或FasL诱导的N4BP1切割，但无法响应LPS或Poly(I:C)。因此，N4BP1的切割依赖TRIF依赖性TLR和死亡受体下游的caspase-8。
此外，表达异位野生型N4BP1，而不是突变型N4BP1 (D488A) 的HEK293T细胞在接受TNF处理后也可产生54 kDa的 N4BP1切割产物，并且这一切割可被emricasan或泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD阻断。总的来说，这些数据表明在多个caspase-8激活受体下游，caspase-8可切割N4BP1。
先前的工作将N4BP1描述为干扰素诱导的病毒限制因子，但N4BP1是否具有其他作用尚不清楚。基于TRIF依赖性TLR诱导的N4BP1切割的有趣模式，作者发现，N4BP1课有效地抑制TRIF非依赖性TLR诱导的选定细胞因子/趋化因子反应。
作者还发现，N4bp1敲除BMDMs中，TLR3和TLR4诱导正常的细胞因子分泌，作者证实caspase-8对N4BP1的TRIF依赖性切割使N4BP1的细胞因子抑制功能失活(图2)。表明，caspase-8对N4BP1的切割失活对于正常的TLR3和TLR4诱导的细胞因子产生是至关重要的。
图2
为了在体内探索以上发现，作者构建了N4bp1-/-小鼠。作者发现N4bp1-/-小鼠出现轻度、年龄依赖性炎症和免疫失调。作者使用了TLR7依赖性银屑病模型，发现与野生型小鼠相比，N4bp1-/-小鼠出现了严重的银屑病样病变。作者还发现N4bp1-/-小鼠在TLR1/2依赖性急性脓毒性休克模型中具有高反应性。N4bp1-/-小鼠在注射Pam3csk4后24小时比野生型小鼠产生明显更多的IL-6、TNF和CXCL1。因此，在TLR7-和TLR1/2-依赖性炎性疾病模型中，N4BP1的缺失都加重了疾病进展。
在体内致病感染过程中，巨噬细胞可能同时遇到TNF和TLR配体。作者的研究证实，TNF诱导caspase-8对N4BP1的切割，赋予TRIF非依赖性的TLR诱导的炎性细胞因子反应(图3)。作者设计了表达抗切割N4BP1(D488A)的敲入小鼠。在10-12周龄时，N4bp1D488A/D488A小鼠没有表现出明显的器官病理学或免疫失调。最后作者得出以下结论，Caspase-8对N4BP1的切割提供了炎症过程中信号整合的关键临界点，使死亡受体如TNFR1和Fas诱导切割并失活N4BP1，从而通过TRIF非依赖性TLR释放增强的细胞因子反应(图3)。
图3
已知TNF阻断剂广泛用于治疗炎症性疾病，但与感染风险增加有关。作者推测，TNF阻断可能通过阻止TNF诱导的N4BP1切割失活而降低对感染的保护作用。为了测试这种可能性，作者利用用肺炎链球菌鼻内感染野生型和N4bp1-/-小鼠，然后用TNFRI-Fc阻断TNF信号。结果发现，与用不相关的抗gp120抗体处理的野生型小鼠相比，用TNFRI-Fc处理的野生型小鼠的死亡率显著增加，N4bp1-/-小鼠即使在TNF阻断后也基本上存活下来。这一发现与N4BP1的失活是细菌感染过程中TNF的重要功能的观点一致；但是，这一观察是否表明N4bp1-/-小鼠对肺炎链球菌的抗性增强或耐受性增加仍不清楚。
综上，作者发现N4BP1被Caspase-8切割并失活。N4BP1是TRIF非依赖性TLR诱导的选定细胞因子/趋化因子反应的重要负调节因子。N4BP1不会抑制野生型巨噬细胞中TLR3或TLR4的反应，这是由N4BP1的TRIF和caspase-8的依赖性切割所致。值得注意的是，完整的N4BP1在caspase-8缺失的巨噬细胞中的持续存在削弱了它们产生强有力的细胞因子反应的能力。与TLR3或TLR4激动剂一样，TNF也诱导N4BP1的caspase-8依赖性裂解，从而诱导TRIF非依赖性TLR产生更高水平的炎症细胞因子。总之，作者发现Caspase-8通过切割N4BP1来整合先天免疫信号。
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2796-5
制版人：Kira