新冠肺炎究竟是从什么时候就开始传播的？这个问题跟病毒溯源一样非常具有挑战性。
日前来自西班牙巴塞罗那大学肠道病毒小组的一项研究让人大吃一惊。研究小组表示，在去年 3 月采集的巴塞罗那废水样本中检测出了新冠病毒，这项研究结果 6 月 13 日发布在预印本论文平台 medRxiv 上；6 月 26 日，西班牙巴塞罗那大学官网再次对这项研究进行了报道，从而引发业内巨大争议。
根据公开报道，欧洲在 2020 年 1 月下旬才在法国报告了首个新冠病例，而西班牙本土直到 2020 年 2 月 25 日才报告确诊首例新冠患者。如果这项研究证据确凿，那意味着新冠疫情演变的时间顺序可能要发生重大变化，世界各地在新冠暴发之前就已经存在感染了。
领导该研究小组的巴塞罗那大学生物学教授阿尔伯特·博世（Albert Bosch）表示，研究小组检查了 2018 和 2019 年的废水样本，目前仅在 2019 年 3 月 12 日的样本中，新冠病毒 PCR 检测呈现阳性，但病毒水平非常低，其他所有样本的检测结果均为阴性。
他认为，巴塞罗那旅游业发达，游客众多，这一研究结果表明世界其他地区很可能也发生了类似情况，许多病例在早期可能被误诊为流感病例，从而被掩盖了。
新冠病毒去年3月已现身？
这项研究是由巴塞罗那大学的罗莎·平托（Rosa Pintó）和阿尔伯特·博世教授领导该校肠道病毒研究小组人员完成的，是新冠病毒“哨兵监测计划”的一部分，资助方为苏伊士环境集团，它是全球最大的水务公司之一。双方合作试图在废水中检测病毒，并考虑为将来新冠疫情的潜在暴发采取预案措施。
尽管新冠肺炎是一种呼吸系统疾病，但诸多研究已证明在患者粪便排泄物中存有大量的冠状病毒基因组，病毒最终混合到废水中，这是基于废水研究新冠流行病学的理论依据，有望在人们尚未察觉的疫情早期检测病毒在人群中的传播，特别是能囊括无症状人群的存在。
此前，已有多国研究人员试图通过废水检测的方式来判断疫情暴发后的潜在波及面有多广泛，以为下次疫情暴发检测提供参考。对此，DeepTech 曾在一文中进行了报道。
巴塞罗那第一例病例于 2020 年 2 月 25 日被报告出来，截至 2020 年 5 月底，该地区病例总数超过 17500 例，是西班牙的重点疫情区。
为了探明巴塞罗那新冠疫情的演变过程，从 2020 年 4 月 13 日到 5 月 25 日，研究人员开始每周对来自两个大型污水处理厂( WWTP1 和 WWTP2 )的 24 小时复合污水样本进行分析，以检测 SARS-CoV-2 的存在情况。此外，也对 WWTP2 的冷冻污水样品进行了检测，这部分冷冻样本时间段是 2018 年( 1 月至 3 月)、2019 年( 1 月、3 月、9 月至 12 月)和 2020 年( 1 月至 3 月)。
具体方法是，通过用 20％ 聚乙二醇 6000 沉淀将 800 毫升废水样品浓缩，并重悬于 3 毫升 pH 7.4 的 PBS 中， 从 1 毫升浓缩物中进行核酸提取，并使用提取系统以 50 微升洗脱。研究方案采取实时 RT-PCR 检测新冠病毒。
重点情况发生在 WWTP2 样本中，因为该组样本覆盖 2019 年 12 月至 2020 年 5 月的时间段，这就有可能更好地分析污水中基因组拷贝数的动态。分析结果出乎人意料，对该组档案样本的分析表明，在 2020 年 1 月 15 日至 3 月 4 日样本中，新冠病毒的基因组就在不断增加，更值得注意的是，巴塞罗那宣布第一例新冠病例( 2 月 25 日)前 41 天( 1 月 15 日)在污水中就能检测到新冠病毒了，研究者认为，这证明废水监测能够有效地预测新冠病例的人口规模。
此外，因考虑到大多数新冠病例会表现出轻微的流感样症状，因此流感病例可能在 2019-2020 年暴发季掩盖了新冠病例情况。这种可能性促使研究人员分析了 2018 年 1 月至 2019 年 12 月的一些存档 WWTP2 样本，结果显示，在 2019 年 3 月 12 日的样本中， IP2 和 IP4 靶点检测均呈阳性。
这一结果的惊人之处在于，它指向早在全球任何新冠病例报告之前，该病毒就在巴塞罗那流通，当地社区中传播着被忽视的新冠病例。
“巴塞罗那是一个商业和旅游中心，也是诸多大型活动的热门场所，巴塞罗那接待了许多外地游客。”博世认为，“世界其他地区也可能发生了类似的情况，而且由于大多数新冠病例表现出与流感相似的症状，这些病例可能伪装成了未确诊的流感。”
业内专家纷纷质疑
新型冠状病毒的出现比人们目前已知的要早得多吗？很多专家对巴塞罗那大学的这项研究表示质疑。
首先，人们怀疑样品被污染。国内一位从事分子生物学研究的研究人员告诉 DeepTech，西班牙这项研究样品制备的浓缩步骤不合适，不规范。
具体而言，其病毒浓缩方法不合适，他们采用了一种聚合物沉淀的方法，需要加入 200 克的某种聚乙二醇，这是一种大量制备病毒的常用方法，而不是微量分析病毒的规范方法。因为假如稍微有污染，其中试剂本身杂质量就会超过病毒，加上未做空白对照实验，就会给出错误结果。
更好的办法是采用膜吸附的方法，可以确保没有任何污染。如果加上有空白对照就会万无一失。这位研究人员认为，西班牙研究还需要公布测得的基因序列，以便确认是否污染了年初以来的新冠病毒。
图｜日内瓦新兴病毒病中心教授伊莎贝拉·埃克尔（Isabella Eckerle）表示质疑（来源：Twitter）
香港大学病毒学专家金冬雁教授对 DeepTech 表示，西班牙这项研究检测的是冠状病毒的高度保守区，因为还可能是其他冠状病毒，只有公布所测样品中冠状病毒基因序列，才可对照分析。另外的问题是，样品扩增了很多倍，却只有很低水平的病毒结果，加上缺乏多样本检测，这就很难排除不是样品污染。
与中国专家的质疑类似，这项新研究结果挑战了目前有关该病毒起源和时间的共识。迄今为止，世界上关于新冠病毒的最早最详细的研究证据都源于 2019 年 12 月的中国武汉地区，并且在 2020 年 2 月疫情才在西班牙出现。
不少外国学者在论文评论区指出了这项新研究的问题，该研究尚未受到外部专家的严格审查，他们认为，由于污染或样品存储不当，测试样本很可能会产生假阳性。
密歇根州立大学环境工程师艾琳·萨戈拉拉基（Irene Xagoraraki）说：“我不相信这个结果。他们的大多数报告内容都描述了从 2020 年初开始的废水处理研究，而关于 2019 年 3 月的最令人惊讶的发现仅在报告末尾才粗略提到。”
对此，西班牙公共卫生与卫生行政管理协会的琼·拉蒙·比利亚比（Joan Ramon Villalbi）博士表示，现在得出明确的结论还为时过早。
他说：“当前只是一个项目的研究结果，但我们唯有参照更多的数据、更多的研究、更多的样品，来确认并排除该实验室的错误或方法学漏洞问题。”
被大幅提前的时间
几十年来，公共卫生工作者一直在污水中寻找各种病毒暴发的迹象，世界卫生组织已经通过这种方式监测了脊髓灰质炎病毒，以评估其疫苗接种运动的效果。这项新研究结果是不是为了博眼球目前尚不能定论，但关于新冠病毒出现的时间，一直在被提前。
此前，其他组织和机构的研究人员们已在荷兰、法国等地的废水中成功检测出新冠病毒的痕迹，但通常情况下，这些研究都是在当地发现疫情之后检测到的。
荷兰 KWR 水循环研究所的微生物学家格特詹·梅德马（Gertjan Medema）认为，一个污水处理厂可以收集超过 100 万人的废水，与逐个人进行测试相比，分析规模级的废水可以更好地估计新冠病毒的传播范围，因为废水检测可以囊括那些未经检测、症状轻微或无症状的人，而卫生当局可能只看到了冰山一角，只关注到了那些发病或重症的人。
此前，荷兰国家公共卫生与环境研究所的研究团队在首都阿姆斯特丹的主机场的废水中检测到了新冠病毒踪迹，这距离荷兰证实其第一例新冠病例仅过了 4 天。
塞巴斯蒂安·伍兹（Sébastien Wurtzer） 是上市公司 Eau de Paris 的病毒专家，该公司负责巴黎市公共供水和废水收集，他们的研究指出，病毒 RNA 在 2020 年3 月 10 日之前的几天内开始呈现出“高浓度”，而这是巴黎记录到新冠肺炎多人死亡的第一天。
近期，不少研究人员表示在确诊病例开始出现之前的几天就提前发现了废水中病毒含量水平的升高。
例如路透社在 6 月 19 的报道，意大利科学家在 2019 年 12 月从米兰和都灵收集的废水中发现了新的冠状病毒的痕迹，这表明在中国报告首例病例之前，新冠病毒已在意大利北部传播。
意大利国家卫生研究院研究了从意大利北部的废水处理厂收集的 40 个污水样品，这些样品是在 2019 年 10 月至 2020 年 2 月之间收集的。分析结果显示，12 月 18 日在米兰和都灵采集的样品存在新冠病毒。科学家表示，在 2019 年底之前检测到该病毒的痕迹与其他国家的证据一致，即在中国于 12 月 31 日发布首个疫情通报之前，新冠病毒可能已经在传播。
相比之下，巴塞罗那大学的这项新研究把这个时间点一下提前了半年多，让人难以置信。最明显的问题在于，这项研究发现新冠病毒可能在 2020 年 3 月份出现，但在往后的诸多样本中却没有出现，有点儿违背逻辑。
该项研究的主要负责人阿尔伯特·博世说：“呼吸道病毒通常在每年的这个时候达到高峰。” “然后病毒可能消失了。”
艾琳·萨戈拉拉基博士认为，阳性结果有可能是其他样本感染病毒的结果。她还怀疑，如果样本没有被深度冷冻，这种冠状病毒是否能够存活一年以上？她说：“如果样本没有储存在 -80 度环境下，你就不能相信结果。”
荷兰 KWR 水研究所的格特詹·梅德马则表示，这项研究来自“知识渊博的研究团队”，因此应认真对待。他补充说：“他们需要以多种方式确认这一发现。”
遗憾的是，这项验证实验可能已难以重复。阿尔伯特·博世对外回应，他的团队无法在阳性样本中重复实验，因为它在第一次测试中就被消耗掉了。他说：“我们从该样本中证明了这一点，但我们无法重复。但样本污染是不可能的。在我们的工作方式中，当有污染时，我们会注意到它。”
当然，证实这一发现的另一种方法是，从 2019 年 3 月在巴塞罗那医院的患者那里搜集的血液样本进行搜索，如果病毒在西班牙传播，甚至短暂传播，那么有些人很可能会因流感样症状而住院。
但综合来看，这项研究进行第二轮实验求证似乎是难上加难的。
-End-
参考：
https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.06.13.20129627v1
https://www.nytimes.com/2020/06/26/health/coronavirus-spain.html
https://www.ub.edu/web/ub/en/menu_eines/noticies/2020/06/042.html
https://www.reuters.com/article/us-health-coronavirus-italy-sewage/italy-sewage-study-suggests-covid-19-was-there-in-december-2019-idUSKBN23Q1J9