2017年可谓是基因治疗大放异彩的一年，在镰状细胞病、脊髓性肌萎缩症、血友病等绝症上，基因治疗屡斩奇功，不得不让人心生期待。而在基因治疗大家庭里，CRISPR更是让科学家寄予厚望。
科学家的期待不难理解。CRISPR快速、精准、体量小、自由度高，不管是用作科研工具还是治疗手段都十分得力，不愧“基因魔剪”的称号。短短十年内，CRISPR已站上风口，无数研究者与企业跟上时代的列车，国内研究者也不甘落后，在CRISPR治疗癌症的临床领域，甚至已先于美国一步展开了临床试验[1]。
然而，这把熊熊燃烧火炬，真的如看起来的那样旺盛吗？
近日，斯坦福大学Matthew H. Porteus教授团队一项研究发现，在七成的健康人体内发现了Cas9蛋白同源物抗体，近半数人具有Cas9蛋白同源物的抗原特异性T细胞[2]。Cas9是目前CRISPR技术使用最广泛的工具蛋白。这项研究的结果意味着，在大部分人体内原本就存在着针对Cas9蛋白的体液免疫和细胞免疫，CRISPR/Cas9在实际人体中的应用效果将很难保证，甚至有可能引发严重的免疫反应。
Matthew H. Porteus教授
CRISPR/Cas9是一种源自于微生物的基因编辑系统，目前使用最广泛的Cas9蛋白是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SaCas9和来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9。
这两位可以说是我们人类的老朋友，却并不是好朋友。它们的出现，往往意味着严重的感染。有研究表明，40%的人类体内存在金黄色葡萄球菌[3]，20%学龄儿童体内存在化脓链球菌[4]，而针对这两种病菌的抗体，几乎100%的成人都有[5-7]。
这不由得不让人深思，来自这两种病菌的Cas9蛋白，是否也会被我们的身体排斥呢？
研究者检测了22份脐带血样和12份健康成人外周血样，利用免疫印迹法对其中的抗体进行检测。抗体能够穿透胎盘屏障，脐带血一定程度上能够代表母体的免疫水平。
结果令人吃惊，在脐带血中，86%检出SaCas9抗体，73%检出SpCas9抗体；在成年人外周血中，67%检出SaCas9抗体，42%检出SpCas9抗体。总的来说，79%具有SaCas9抗体，65%具有SpCas9抗体！
鉴于对脐带血和外周血样本的处理方法有差异，Cas9蛋白抗体可能对处理方法敏感，两类样本出现了略有不同的结果。实际上的检出数字，可能会更高。
研究者进一步利用细胞因子捕捉系统（CCS）检测了血样中的Cas9抗原特异性T细胞。在3份来自健康成人的外周血样中，46%检出了SaCas9抗原特异性T细胞，其中的71%也具有SaCas9抗体；SpCas9则未有检出。但这并不意味着SpCas9特异性的T细胞不存在。实验中，研究者曾检测到SpCas9相关T细胞的蛛丝马迹，但是鉴于CCS系统的灵敏度有限，实验结果无法重复，只能记为未检出。
从左至右分别为样本、阳性对照组、阴性对照组
实验采用脐带血作为阴性对照组。新生儿并未接触过抗原，不存在相关的特异性T细胞。在CCS检测中，接触了Cas9蛋白也没有产生特异性T细胞。这也证明，人血样中检测到的SaCas9抗原特异性T细胞，是原本就存在的，而不是在检测过程中由于首次暴露于抗原产生的。
目前的CRISPR/Cas9技术有体外编辑和体内编辑两个方向。在体外编辑时，一般使用电穿孔转染将编辑系统引入细胞；体内编辑则往往使用病毒载体或者纳米粒子包埋的形式。在这种情况下，Cas9蛋白并不会直接接触到相应的抗体。
但是，Cas9蛋白进入了细胞并不意味着安全。细胞依旧可以通过MHC抗原递呈等方式，通知免疫系统内部有敌。这让免疫系统积极清除经过Cas9改造的细胞，导致治疗毫无效果。考虑到治疗范围，如果改造细胞遍布全身，这种杀敌行为将会造成严重的全身免疫问题。
这意味着，人的适应性免疫将会成为CRISPR基因疗法的巨大壁垒，而且这种风险并不能够在非人系统中轻易排除[8]。
此文一出，CRISPR技术的前景再次遭受市场质疑。纵然未来可能会有新技术解决这个潜在的问题，但短期内，该领域的先锋技术公司必将受到冲击。周五论文发表后，Editas股价下跌0.7%，Intellia下跌2.7%，一直被看好的CRISPR Therapetutics也略有萧瑟之感[9]。
至于如何解决这个问题，Porteus教授提出三种思路。加快Cas9的耗竭、免疫抑制、寻找新来源的Cas9蛋白。不管到底哪个能真的破局，前方的道路必定充满艰辛。
1999年，美国男孩Jesse Gelsinger在基因治疗过程中，因剧烈的免疫反应去世，自此结束了十年间业界对基因治疗的狂热追捧。2017年，CRISPR屡登顶级期刊，2018年预计开展的诸多临床项目看起来大有可为。
一条生命已经足以令技术发展停滞甚至倒退，希望研究者在科学的路上慎而又慎，愿CRISPR这把火长久地照亮未来。
参考资料：
[1]https://gizmodo.com/in-2018-we-will-crispr-human-beings-1821540150
[2]https://www.biorxiv.org/content/early/2018/01/05/243345
[3]F. D. Lowy, Staphylococcus aureus Infections. New England Journal of Medicine 339, 520-532 (1998).
[4]A. L. Roberts et al., Detection of group A Streptococcus in tonsils from pediatric patients reveals high rate of asymptomatic streptococcal carriage. BMC Pediatrics 12, 3 (2012).
[5]P. Colque-Navarro, G. Jacobsson, R. Andersson, J.-I. Flock, R. Mllby, Levels of Antibody against 11 Staphylococcus aureus Antigens in a Healthy Population. Clinical and Vaccine Immunology : CVI 17, 1117-1123 (2010).
[6]A. Dryla et al., Comparison of Antibody Repertoires against Staphylococcus aureus in Healthy Individuals and in Acutely Infected Patients. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12, 387-398 (2005).
[7]R. Mortensen et al., Adaptive Immunity against <em>Streptococcus pyogenes</em> in Adults Involves Increased IFN-γ and IgG3 Responses Compared with Children. The Journal of Immunology 195, 1657 (2015).
[8]W. L. Chew et al., A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response. Nat Meth 13, 868-874 (2016).
[9]https://www.fiercebiotech.com/biotech/new-paper-could-put-crispr-biotechs-under-pressure