导读：mRNA疫苗在减轻/预防严重COVID-19方面的成功，为开发治疗其他传染性疾病的疫苗开发提供了启发，如至今尚无一款疫苗上市的人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV-1是一种可整合到宿主细胞基因组中的慢病毒，并在受感染细胞的生命周期内持续存在，其多种免疫逃避机制极大地阻碍有效HIV-1疫苗的开发。
2024年9月，明尼苏达大学Shamim Ahmed和Alon Herschhorn在Clinical Microbiology Reviews（IF:19）发表高质量综述《mRNA-based HIV-1 vaccines》，概括了当前应用于HIV-1领域的mRNA疫苗的开发策略及不同靶向方法，并就HIV-1 mRNA疫苗的挑战和未来发展提出了深度见解。
01
背景介绍
1.1 mRNA疫苗的优势
疫苗被认为是预防传染病传播最有效的医疗干预措施之一，与传统减毒活疫苗/灭活疫苗相比，mRNA疫苗能促进CD4+ Tfh细胞的分化并诱导生发中心B细胞应答，使用低剂量mRNA-LNP疫苗进行单次免疫会触发强烈的CD4+ T细胞反应，包括Tfh细胞，并在小鼠和恒河猴中引发抗HIV-1-gp 120 IgG应答，Tfh细胞反应可能在诱导特异性和持久的B细胞反应中发挥作用。IVT mRNA疫苗具安全性更高、疗效好、成本效益高、易于大规模生产、稳定性好且可减少不必要的炎症反应等优势。
图1 mRNA疫苗发展的历史性里程碑
1.2 mRNA类型及mRNA-LNP
现已有两种技术路线的IVT mRNA疫苗获批上市：（1）非复制mRNA：常编码一种特异性免疫原，含5'-和3'-非翻译区（UTR）和poly（A）尾；（2）自扩增mRNA（saRNA）：还编码一种来源于甲病毒的RNA依赖性RNA聚合酶，该酶表达后可识别saRNA中的特定元件并在宿主细胞中扩增saRNA分子，saRNA疫苗可减少免疫剂量和次数。截至2024年初仅一种saRNA疫苗被正式批准用于人体。其中，mRNA中的5' Cap提高了mRNA的稳定性，保护其免受胞内降解，促进体内高效翻译；5'-和3'-UTR区增强蛋白表达，调节翻译起始，并影响mRNA稳定性；poly（A）尾影响翻译效率及保护mRNA；核苷碱基修饰（如假尿苷或N-1-甲基假尿苷）提高mRNA的稳定性及翻译效率。mRNA纯化的进步减少不必要的炎症反应并增强适应性免疫应答。
mRNA-LNP可同时作为免疫原和佐剂发挥作用；核苷修饰的mRNA介导免疫原表达且无明显的炎症反应，基于可电离阳离子脂质（如DLinDMA）的LNP优于广泛使用的MF59样佐剂AddaVax，可自然增强小鼠的免疫应答，促进强健Tfh细胞、生发中心B细胞、长寿命浆细胞和记忆B细胞生成。mRNA-LNP可以剂量依赖性方式经六个常用的注射位点有效递送，翻译蛋白的动力学取决于剂量和递送部位，首次通过肌肉注射在人体中测试的mRNA-LNP疫苗介导了SARS-CoV-2刺突三聚体的表达。疫苗给药方法和途径显著影响mRNA摄取并影响抗原呈递细胞对表达的免疫原的加工。
高效、安全的RNA载体的开发在某些情况下能够延长体内免疫原表达。mRNA-LNP的脂质组成及配方差异显著影响其储存要求、细胞靶向、功效和安全性。如当肌肉注射免疫小鼠时，相较于辉瑞公司COVID-19疫苗中的可电离脂质ALC-0315，Moderna疫苗中的可电离脂质SM-102能更有效地递送mRNA，并产生更高的抗体反应，且在相同储存条件下SM-102 mRNA-LNP更稳定。
近年来，mRNA疫苗领域正在迅速发展。本综述概括了目前HIV-1 mRNA疫苗的最新发现，并提供了对HIV-1 mRNA疫苗未来的见解。
02
HIV-1疫苗的免疫学基础
目前，全球约有3900万人感染HIV-1（PLWH），但开发有效的HIV-1疫苗仍面临诸多障碍：如HIV-1前所未有的产生耐药性和逃避免疫系统的能力、HIV-1毒株的广泛多样性、难以从稀有种系前体中启动广泛中和抗体（bnAb）、降低T细胞识别的病毒机制、替代糖基化模式以及当前候选疫苗短暂的抗体反应。唯一证明具有保护作用的HIV-1有效性临床试验，是由泰国军事HIV-1研究计划（NHRP）进行的3期HIV-1疫苗试验（RV144），尽管是适度和暂时的。获得的保护与针对HIV-1包膜糖蛋白(Env) gp120 V2环的1级(非/弱中和)抗体有关，可能通过HIV-1感染细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)实现的。常用作HIV-1感染动物模型的恒河猴的猴免疫缺陷病毒（SIV）攻击试验表明，巨细胞病毒（CMV）介导的SIV蛋白表达可导致呈递SIV衍生肽的非经典人白细胞抗原E (HLA-E)的有效T细胞应答。但近年来诱导T细胞应答疗效实验的失败使人们越来越关注激发有效的体液免疫。
图2 2022年全球15-49岁艾滋病毒感染者的流行率
评估通过不同方法递送的候选疫苗，包括基于病毒（改良的痘苗安卡拉、腺病毒5、26）、DNA和蛋白质（使用不同佐剂的亚单位疫苗）的方案。最近的试验包括Uhambo（HVTN702）：测试canarypox-protein HIV-1疫苗方案（ALVAC-HIV+可溶性C亚型gp120，NCT02968849）；及Imbodoko（HVTN705）和Mosaico（HVTN706）两项试验：测试了使用Ad26.Mos4.HIV和clade Cgp140（NCT03060629和NCT03964415）的腺病毒蛋白HIV-1疫苗方案，但都无法建立一种强大的方法来引发保护性免疫。与其他疫苗类似，mRNA-LNP可诱导适应性免疫系统的两个分支，且mRNA序列易于修饰、低成本和诱导Tfh细胞水平增加，这是强大的体液反应所必需的。
图3 HIV-1 mRNA疫苗诱导适应性免疫系统的两个分支
03
靶向HIV-1 Env
HIV-1 胞膜蛋白（Env）在病毒粒子表面及感染细胞上表达，可介导病毒进入宿主细胞，为HIV-1疫苗/中和抗体的主要靶标，且它们是感染细胞表面唯一表达的病毒蛋白，故成为ADCC消除病毒感染细胞的唯一靶点。HIV-1 Env免疫原可在三个水平上诱导免疫反应：引发病毒中和抗体、形成介导ADCC活性的抗体及针对Env衍生肽的T细胞反应，这些肽在HIV-1感染细胞表面的MHC I类（又称HLA）上呈递。
图4 HIV-1 Env免疫原诱导免疫反应的3种方式
HIV-1 Env形成三聚体刺突，包括非共价结合的三个gp120外部亚基与三个gp41跨膜亚基：gp120与宿主CD4受体和CCR5/CXCR4共受体结合，gp41促进病毒和靶细胞膜的融合。相较于经酸性内体进入靶细胞的病毒，HIV-1可在中性pH下经融合进入靶细胞且只能通过受体/共受体结合才能触发完成进入过程。研究显示一些原代菌株的Env构象可能不完全闭合，且对靶向内部Env表位的抗体敏感，受感染细胞表面的内吞作用和Env亚稳态导致Env在受感染细胞上的低水平表达，且HIV-1病毒粒子上HIV-1 Env刺突的密度极低（~14个Env刺突/病毒粒子）。低Env密度减少HIV-1 Env在感染期间或免疫后向免疫系统的有效呈递。
bnAb靶向HIV-1 Env上高度保守的表位，并阻断多种HIV-1毒株的进入。研究确定HIV-1 Env至少含7个bnAb靶向的易感性位点，bnAb对特定Env构象或多种构象具有活性，向免疫系统提供不同Env构象可能有助于增加抗体广度或激发针对Env构象异质性的多克隆抗体，疫苗接种诱导的中和抗体必须足够广泛和有效，以中和多种HIV-1毒株。
04mRNA疫苗中使用的不同形式的HIV-1Env
不同形式的HIV-1 Env目前正在进一步开发中，每一种都代表了诱导对HIV-1有效免疫反应的不同途径。
图5 编码HIV-1 Env的mRNA呈现给免疫系统的不同形式
4.1 可溶性HIV-1 Env
包括gp120 V1/V2支架蛋白 、gp120亚基、gp140胞外域和SOSIP
HIV-1 Env三聚体以亚稳态构象锚定在HIV-1病毒粒子的膜中，该构象受不同Env元件（包括跨膜（TM）结构域）控制。因此，可溶性天然Env胞外结构域在重组表达时无法结合到稳定的三聚体中，故许多研究使用不同形式的可溶性Env：固定在支架蛋白上的gp120结构域、可溶性gp120单体、可溶性gp140(外结构域)或三聚化结构域-Env融合蛋白产生的gp140三聚体。
基于RV144有效性试验，使用短碳纳米管开发一种将最小gp120 V1/V2环嫁接在支架蛋白（2F5K）上的mRNA疫苗。纳米管（NanoVac）长度100-200nm，直径60-100nm，并经化学修饰允许使用阳离子聚合物装载mRNA，保护mRNA免受降解。NanoVac候选物在家兔中诱导免疫应答，在人源化小鼠中产生人源化抗体和细胞应答，1/3小鼠能抵御HIV-1LAI/BaL单次静脉注射的攻击。
用陆军脂质体制剂QS21 (ALFQ)或含编码HIV-1A244 gp120的mRNA-LNP对恒河猴进行可溶性HIV-1A244 gp120(缺少gp120前11个N端氨基酸的gp120亚单位疫苗)免疫，可产生相当滴度的gp120特异性血清IgG。含编码HIV-1SF162 gp140的mRNA-LNP研究显示小鼠产生的抗原及免疫原性增加。在种系靶向免疫原设计方法中，人们越来越多地致力于工程重组HIV-1 Env的研究，它们与种系编码B细胞受体（BCR）具有高亲和力，可引导抗体反应发展为bnAb，基于gp120外结构域并以AS01B为佐剂的疫苗候选药物eOD-GT8 60mer表现出良好的安全性，并成功在97%的疫苗接种者中诱导VRC01类bnAb前体，前体表现出与完全发育的bnAb相似的特性，并包含代表亲和力成熟后的体细胞超突变。
表2 已完成和正在进行的HIV-1 mRNA疫苗临床试验
最近经过充分研究的可溶性Env蛋白（SOSIP.664 gp140 Env三聚体）通过大量缺失和引入几种氨基酸进行修饰，以提高稳定性和溶解度。在SOSIP三聚体中，gp41的TM、细胞质尾部和膜近端外部区域被删，用SOSIP Env三聚体对恒河猴和兔子进行免疫确实诱导较弱和/或菌株特异性的抗体反应，但其在HIV-1病毒粒子上模仿天然Env构象的能力仍存在争议。
VRC26.25是一种靶向Env三聚体的有效bnAb，在移植了表达VRC26.25重链互补决定区3（CDR3）的多种B细胞的小鼠中评估不同SOSIP变体的免疫原性。比较来自不同HIV-1毒株的可溶性SOSIP与工程化跨膜SOSIP（SOSIP-TM）的免疫反应，结果发现以mRNA-LNP方式递送的SOSIP-TM比多聚化SOSIP蛋白引起更强的中和反应，且SOSIP-TM在B细胞中引发通过体细胞超突变进行亲和力成熟的中和抗体。
编码clade C Env的saRNA疫苗在动物模型中表现出强烈的体液和细胞免疫应答，该研究评估了病毒（使用阳离子纳米乳(CNE)）、非病毒（封装在病毒复制子颗粒（VRP）中）两种递送系统的安全性和免疫原性：saRNA-CNE疫苗诱导的强效细胞免疫反应远超saRNA-VRP或用MF59配制的重组HIV-1 gp140 Env触发的细胞免疫反应，且saRNA-CNE疫苗引发强烈的抗Env结合（包括抗gp120 V1/V2环）及中和抗体反应。
4.2细胞表面表达的膜锚定HIV-1 Env
抗体反应虽常针对病毒（或细菌）表面的可溶性蛋白和/或Env引起。但在免疫个体中，膜锚定的SARS-CoV-2刺突在宿主细胞表面的表达诱导强中和抗体。同样在宿主细胞表面表达的膜锚定HIV-1 Env诱导种系BCR到bnab的发育途径。使用编码膜锚定Env三聚体的mRNA（对种系BCR前体表现出高亲和力）对表达bnAb PCT64种系BCR的工程化小鼠进行免疫，诱导的免疫应答优于等效可溶性Env的反应，显著增加B细胞活化和特异性bnAb前体向生发中心的募集，并降低其亲和力阈值。在用不同bnAb前体VH+VL基因敲入的小鼠中，用编码膜锚定HIV-1 gp160的mRNA免疫会引发强效的自体中和抗体。
HIV-1 clade C是全球HIV-1人群的重要贡献者。传播/始祖HIV-1毒株可在体内建立HIV-1感染，是预防性疫苗开发的主要靶点。核苷修饰和纯化的编码膜锚定clade C传播/始祖HIV-1 Env 1086C的mRNA-LNP被皮下注射给兔和恒河猴，触发产生大量gp120特异性抗体，兔子产生的抗体可有效中和1级病毒，1/2的恒河猴产生能中和自体（1086C）2级HIV-1毒株的抗体，来自免疫兔和恒河猴的血浆IgG有效介导ADCC活性。
4.3 病毒样颗粒（VLP）上的膜锚定Env
先前研究报道在病毒粒子上多拷贝(高密度)水疱性口炎病毒G蛋白对诱导有效抗体应答的优势。因此投入大量精力模拟Env的自然、多拷贝呈递。在小鼠和恒河猴中评估编码多clade env-gag的mRNA-LNP疫苗，结果在猴中引起体液和细胞免疫应答，重复免疫诱导了针对12种全球HIV-1毒株中的11种的广谱2级但相对较低的中和滴度，接种疫苗的动物对SHIVAD8病毒的粘膜攻击具有显著的保护作用，每次暴露的风险降低79%。
最近开发了一种mRNA疫苗，编码细胞质尾缺失（△CT）的HIV-1AD8 Env免疫原和HIV-1 Gag。将这两种mRNA共同配制成LNP，在体外产生表达HIV-1AD8△CT Env的VLP，用mRNA-LNP免疫家兔，少部分家兔产生微弱但增强的中和反应。显然，该方法诱导一种与可溶性Env结合程度较低的特定抗体，同时显著增强其对基于HIV-1的假病毒的总体中和作用。因此，改进的基于mRNA的方法在VLP上呈递天然、稳定和高密度的HIV-1 Env可能有利于中和抗体的诱导。
05
mRNA疫苗接种诱导T细胞
对HIV-1的反应
2009年基于DC的自体免疫疗法AGS-004在接受抗逆转录病毒疗法（ART）治疗成功的成人中进行评估，9名测试者中有7名表现出由AGS-004触发的完全或部分HIV特异性免疫应答，这些应答优先诱导CD8(+) T细胞应答。在恒河猴中评估编码HIV-1 Gag或HIV-1 p24Gag内保守区(CE)的mRNA-LNP疫苗的细胞应答。根据以下因素选择CE:（1）在已知HIV-1菌株中具高保守性（>98%）；（2）被长期非进展性HIV-1感染个体识别；（3）具有广泛HLA覆盖的保守表位。mRNA-LNP疫苗诱导低适应性T细胞反应。
解决HIV-1多样性问题的一种方法是开发一种包含不同菌株的HIV-1衍生表位的镶嵌疫苗。使用复制缺陷的Ad26载体或DNA启动重组痘苗加强方案对非人灵长类动物用嵌合抗原进行免疫，可引发CD8+ T细胞反应。相同的镶嵌概念应用于tHIVconsvX（从HIV-1 gag和pol的六个高度保守区域的二价嵌合体计算得到）免疫BALB/c和远交系小鼠实验，可诱导广泛特异性、多功能的CD8+和CD4+ T细胞，诱导的T细胞在体外肽再刺激后表现出多种效应功能，在体内有效靶向表位变体，并显示出包含效应细胞和中枢记忆细胞在内的结构化记忆亚群。
06
基于mRNA递送的抗体介导的预防
分析治疗中断期间向PLWH输注bnAb的临床免疫治疗试验发现，少数患者即使在bnAb给药几个月后（未经治疗）仍未检测到HIV-1病毒血症，故进一步验证编码bnAb的mRNA的递送是否具有相同的效果。
编码VRC01 bNAb的mRNA-LNP靶向人源化小鼠的受体(CD4)结合位点，产生大量抗HIV-1的保护性抗体。在小鼠体内也检测到mRNA-LNP组合表达三种靶向HIV-1 Env的bnAb的高水平表达。上述研究表明小鼠静脉注射1mg/kg mRNA混合物后，bnAb可维持在至少10μg/mL的水平长达90天。利用合成mRNA在女性生殖道中产生靶向gp120 V3-聚糖的PGT121 bnab，单次给药后，在绵羊生殖道中检测到持续28天的抗体表达。
07
挑战及展望
对所有clade HIV-1毒株有效的疫苗是HIV-1疫苗开发的长期目标。但鉴于过去四十年来开发有效疫苗的极端障碍和困难，即使是clade特异性疫苗也将是一个突破性的里程。
有效的预防性HIV-1疫苗需：（1）通过阻止所有HIV-1病毒粒子进入靶细胞来触发无菌免疫；（2）清除整合后HIV-1复制的新病灶或保持对任何未来复发病毒的保护性免疫。不同抗体和细胞毒性T细胞清除HIV-1病灶的能力目前尚不清楚。
HIV-1 mRNA疫苗可能被用作预防性或治疗性干预措施，但二者存在一些差异。预防性疫苗应广泛而有效地对抗不同的HIV-1主要株，并一次对一种或多种病毒攻击产生反应。而治疗性疫苗的范围应侧重于克服HIV-1对抗体的潜在抵抗机制，且应提供长期和持久的免疫应答，以应对可能重新激活HIV-1并导致病毒种群补充的潜伏细胞。
最后，与抗击全球病毒大流行相关的一个主要问题是全球疫苗分配的公平性。总之，基于mRNA的技术为开发HIV-1疫苗、激活Tfh细胞以产生更有效的反应及诱导针对HIV-1的T细胞和抗体反应提供了令人兴奋的机会。
参考文献
[1] Ahmed S, Herschhorn A. mRNA-based HIV-1 vaccines. Clin Microbiol Rev. 2024 Sep 12;37(3):e0004124. doi: 10.1128/cmr.00041-24.
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撰写| 工程菌星球
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice