核仁素（nucleolin, NCL）作为细胞内一种多功能蛋白，在细胞内广泛分布，如核仁、胞浆及细胞膜上。大量研究表明 NCL 在生理和病理情况下都参与许多细胞的生命过程，并且发现 NCL 的功能与其分布密切相关。
中国农业科学院兰州兽医研究所郭惠琛团队在Journal of Virology杂志发表了题为“Nucleolin Promotes IRES-Driven Translation of Foot-and-Mouth Disease Virus by Supporting the Assembly of Translation Initiation Complexes”的研究论文。在研究中，作者发现核仁素蛋白可以和口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FDMV）的IRES(II 型 IRES)相互作用。在病毒感染过程中，核仁素由核仁重新定位至胞浆，且核仁素作为一种促病毒因子通过参与翻译起始复合物的形成来直接调控病毒蛋白质的产生并间接调控病毒RNA的合成。最后，通过体外动物实验，证实了核仁素在口蹄疫病毒致病性中的功能。本研究揭示了核仁素蛋白在IRES介导的翻译过程中的重要作用，确定了核仁素可作为广谱抗病毒药物的一个靶点。
在真核细胞中，翻译起始通过两种不同的机制发生：经典的帽依赖（cap-dependent）途径和核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）介导途径。在经典的帽依赖途径中，含40S亚基和众多翻译起始因子的43S起始前复合物(preinitiation complexes，PICs)首先被加载到的帽近端区域。附着后，43S复合物从帽向下游扫描直至AUG起始密码子， 48S起始复合物在此组装。随后eIF1的移位导致elF5介导elF2结合的GTP的水解，60S亚基的加入以及随之而来的由eIF5B介导的其他eIFs的解离，eIF5B水解GTP触发eIF5B-GDP和eIF1A的释放并产生最终的80S起始复合物。
与帽依赖的翻译不同，IRES介导的翻译起始可以在没有帽识别结合和常规核糖体扫描情况下进行。IRES元件具有复杂的二级和三级结构，其由茎环和假结组装而成，它们介导了与核糖体的内部结合，进一步通过多种RNA-RNA和RNA -蛋白的相互作用起始蛋白质翻译过程。在不同病毒的mRNA中已经发现了许多的IRES，另外，在细胞中，一些参与应激反应、细胞周期和凋亡的mRNA中，也存在IRES元件。值得注意的是，IRES介导的翻译可以在占主导地位的帽依赖翻译途径被关闭时发生，病毒可以利用这一点挟持宿主翻译功能来指导病毒本身蛋白质的合成。
病毒的IRES元件根据其招募核糖体的方式、行使功能所需的eIFs、二级结构的相似性分为四类。I型和II型IRES：仅在小RNA病毒中被报道，其拥有大且柔性的二级结构，需要大量的eIFs和ITAFs才能进行有效的核糖体组装。III 型IRES：只需很少的eIFs and ITAFs。IV型IRES：无需任何IRES即可促进翻译。
口蹄疫病毒属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，是一种在细胞质中复制的病毒，其基因组为单股正链的RNA，长度约8500 bp。基因组结构包含5’UTR，一个开放阅读框，3’UTR，其IRES为II型IRES。在病毒感染期间，病毒的Lpro和3Cpro切割细胞内一些蛋白，导致帽依赖的翻译途径被快速关闭，从而消除了通过IRES介导翻译的病毒蛋白质合成的竞争。
首先，研究人员发现当敲低细胞内NCL时，FMDV感染PK-15细胞后，病毒滴度下降；过表达细胞内NCL时，病毒滴度增高。在PK-15细胞中，敲低细胞内NCL时，病毒蛋白表达水平降低；过表达NCL时，病毒蛋白表达水平升高。在BSR-T7细胞中，分别敲低和过表达NCL，将携带EGFP的复制子（rFMDV-EGFP）转染细胞，发现荧光表达水平在NCL敲低的BSR-T7细胞中降低，反之，复制子活性在NCL过表达细胞中升高。
随后，作者通过构建双顺反子报告质粒确定NCL对于FMDV IRES介导的翻译过程的影响。结果显示，下调NCL的表达，Fluc活性降低；上调NCL的表达，Fluc活性升高。这表明NCL是FMDV IRES介导的翻译过程的调控因子，并直接作用于病毒的翻译过程。在病毒RNA水平上，趋势与此相同；为将病毒翻译过程和RNA转录过程区分开，在病毒感染后2小时和3小时分别添加蛋白质合成抑制剂CHX（cycloheximide)。这表明NCL对病毒RNA合成的影响是间接作用，可能是复制所需的病毒蛋白在NCL敲低细胞中减少引起的。
在RNA-pulldown、反转录实验表明NCL与FDMV基因组相互作用后，作者进一步对NCL与病毒基因组相互作用区域进行分析，将病毒基因组各区域分别与NCL进行RNA-pulldown。结果表明，NCL只能与病毒5’UTR或IRES相互作用；另外，生物素标记的FMDV IRES和NCL的特异性结合可以被未被生物素标记的FMDV IRES抑制。分别将病毒的IRES进行截短体外转录，经RNA-pulldown，说明IRES的domain 5在IRES和NCL的结合中至关重要。
接下来，作者发现病毒感染期间FDMV的 3C蛋白通过发挥其蛋白酶活性诱导 NCL 发生细胞质转位。当突变3C H46Y, D84N, C163G时，蛋白酶活性丧失，NCL不发生重定位，而突变H205R时，蛋白酶活性保留，NCL仍出现重定位现象。进一步将双顺反子荧光素酶报告质粒转入细胞，进行接毒感染实验（病毒感染可以使NCL从核仁转移至胞浆），发现相比于对照细胞，病毒感染后，病毒IRES介导翻译的Fluc活性显著提升。这表明在病毒感染期间，NCL的重定位有助于病毒蛋白的翻译。
最后，作者发现NCL可以和多种eIFs结合，包括eIF4A、eIF3a、eIF3e、eIF3j、eIF2a、以及PABP(酪氨酸结合蛋白)和RPS6(核糖体40S小亚基组成成分)。且当细胞中下调表达NCL时，翻译起始因子与病毒IRES的相互作用被竞争性抑制。以上结果均表明NCL参与FDMV蛋白翻译的起始过程。
总的来说， NCL在FDMV 复制中发挥重要作用 。 在 病毒 感染后，3C蛋白通过其 蛋白酶活性 诱导NCL从核仁重定位至细胞质与病毒的IRES特异性结合，继而参与翻译起始复合物的形成。
本文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33853964/
本文来源：哈兽牛羊病之家微信公众号
本期编辑：小黄