*仅供医学专业人士阅读参考
RNA测序显著补充了基因融合DNA测序的不足。
肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%[1]。准确而全面地研究NSCLC患者的特定基因突变，有助于通过使用靶向药物的治疗显著改善患者的结局和预后。二代测序（NGS）技术被美国国家综合癌症网络（NCCN）和中国临床肿瘤学会（CSCO）指南推荐用于检测高通量基因变异，这将指导NSCLC患者的靶向治疗 [2] 。
目前，基因组DNA（gDNA）和全外显子测序（WES）通常用于NGS基础靶向治疗分析肿瘤组织样本中的变异，这些变异包括单核苷酸变异（SNV）、插入/缺失变异（indel）和拷贝数变异（CNV）。与此同时，信使RNA（mRNA）已被更广泛地用作识别融合和进行基因表达分析的输入模板。然而，由于表达水平变化较大，mRNA很少用于检测SNVs或indel等体细胞突变，导致准确性受限。46%–49%由DNA测序鉴定出的基因异常只能通过RNA测序分析检测到，特别是所有端粒酶逆转录酶（TERT）突变均未能通过RNA测序鉴定[3]。因此，亟待通过DNA和RNA测序的结合全面准确地探索基因变异特征，用以NSCLC患者潜在药物靶点的鉴定。
近期，评估DNA和RNA测序在基因融合中检测效果的研究全文发表于《Discover Oncology》。结果显示，使用RNA测序检测到的基因融合数量和类型优于使用DNA测序， RNA测序显著补充了基因融合DNA测序的不足 ，协同呈现了全面可靠的基因变异特征。这些发现对于NSCLC患者潜在药物靶点的鉴定以及精准治疗和预后评估具有重要的指导意义。现撷取重要内容整理如下，供读者参考。
研究方法
该研究纳入了2020年6月至2022年10月期间386例患有Ⅱ～Ⅳ期NSCLC的患者，在研究中，II期、III期和IV期病例分别占16.3%、32.9%和50.8%。339例（87.8%）为肺腺癌（LUAD），47例（12.2%）为肺鳞状细胞癌（LUSC）。研究使用MagPure FFPE DNA试剂盒B（Magen,China）提取福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本的基因组DNA；使用MagPure FFPE RNA/DNA试剂盒（Magen,China）从FFPE样本中提取RNA。该研究评估DNA和RNA测序在基因融合中的检测效果，用以鉴定NSCLC患者潜在的药物靶点。
研究结果
01
使用NGS的CSCO指南中潜在的有据可查的靶驱动基因
根据NSCLC CSCO 2022指南，检测 EGFR 、 KRAS 、HER2和BRAF基因的SNV/indel，MET和HER2的CNV，ALK、ROS1、RET和NTRK的基因融合以及MET外显子14跳跃（METex14），这将为基于这些基因变异的NSCLC靶向药物的临床应用提供依据。
在NSCLC队列中使用DNA面板或RNA面板测序进一步探索基因融合。然而，fisher精确检验显示，DNA和RNA面板测序在检测ALK、ROS1、RET、NTRK和METex14基因方面无显著差异（p>0.05，图 1 D）。NSCLC队列中含有ALK、ROS1、RET、NTRK或METex14的基因融合数量相当（图 1 E）。两种策略同时检测到50%（26/52）的基因融合，其余50%通过DNA或RNA面板测序互补发现（图 1 E）。令人惊讶的是，DNA面板测序对ALK、ROS1、RET、NTRK或METex14的基因融合类型的检出率高于使用RNA面板（图 1 F）。这些数据表明，DNA测序结合RNA测序相结合可以更全面和可靠地显示NSCLC队列中基因的变异。
图1.根据CSCO的临床指南，NGS检测在NSCLC诊断和治疗中的作用
注：图 1 A.覆盖前述所有驱动基因的DNA组测序（769个基因）用于EGFR、KRAS、HER2和BRAF基因的SNV/indel检测；图 1 B.MET和HER2基因的CNV；图 1 A，B.NSCLC队列中EGFR的SNV/indel数为201例（52.1%），MET的CNV数为16例（4.1%）；图 1 C.通过DNA和RNA面板测序检测ALK、ROS1、RET、NTRK和METex14的基因融合。
02
NSCLC队列中DNA和RNA序列的基因变异情况
在NSCLC病例中，研究者使用DNA面板测序进一步展示了前20个基因的SNV/indel图谱，其中TP53和EGFR的SNV/indel频率分别为60%和55%（图 2 A）。图 2 B显示NSCLC队列中CDKN2A、MYC、EGFR和CDK4基因的CNV率分别为15.9%、12.4%、8.2%和7.4%。其中，CDKN2A基因为拷贝数缺失，而MYC、EGFR和CDK4基因拷贝数增加。NGS检测到的EML4-ALK融合在所有基因融合中最多，其在NSCLC队列中的比例为8.2%。尽管根据CSCO指南，DNA和RNA面板测序检测到的基因融合率相似（图1E、F），但使用RNA面板测序检测到的基因融合数量和类型比通过DNA面板测序检测到的更多（图2D、E）。因此，RNA面板测序对于NSCLC队列中基因融合的缺陷进行了很好的补充，共同揭示了NSCLC中更全面的基因变异特征。
图2.NSCLC队列中SNV/indel、CNV和基因融合概况
03
使用DNA和RNA面板测序检测罕见基因融合
根据定义，在NSCLC队列中只在DNA和/或RNA面板上检测到一次的融合基因被视为罕见基因融合。如图3A所示，该队列中共发现了40个罕见融合。其中，有4个基因融合，包括FBXL20-EGFR、FGFR4-PYGO1、HIP1-ALK和IRF2BP2-NTRK1，同时通过DNA和RNA面板测序发现。35%的罕见融合通过DNA面板检测到，55%的罕见融合通过RNA面板检测到。只有通过DNA面板才检测到基因融合与基因间区域相关的情况，包括基因间（AKIRIN1,NDUFS5）-NTRK2、基因间（ZNF318,ABCC10）-EZR、基因间（POTEC,ANKRD30B）-PDGFB、基因间（LINC00487,NRIR）-ALK和ALK-基因间（ALK, YPEL5）（见图3A）。RNA面板测序检测到的具有驱动基因（如TAF4-MET和SND1-MET）的基因融合可能提供了靶向药物方向（见图3B、C）。此外，面板范围之外的基因变体没有被测量，需要进一步使用全基因组测序或转录组测序进行评估。
图3.通过DNA和RNA面板测序检测罕见基因融合
04
使用DNA和RNA测序检测METex14
在NSCLC队列中，研究者发现通过DNA或RNA面板测序有五位患者携带METex14。DNA测序显示有11个NSCLC病例携带MET突变，其中只有一个病例在c.3028G>A位点发生MET突变，这预示着在mRNA加工过程中发生了MET外显子14的剪接。通过RNA面板测序也证实了METex14的存在（见图4A）。有四例METex14患者仅通过RNA面板测序发现（见图4B）。因此，相比DNA测序，使用RNA测序更容易检测到METex14。
图4.使用DNA和RNA测序检测METex14
05
SNV/indel/CNV/基因融合与临床特征的相关性
研究进一步分析了在NSCLC队列中SNV/indel/CNV/基因融合与临床特征的相关性。如图5A-C所示，TP53、EGFR和KRAS的SNV/indel率与性别（图5A）、吸烟（图5B）和癌症亚型（图5C）显著相关。当然，一些基因，如EGFR在不同年龄和临床分期间存在显著差异。在男性、吸烟者和 LUSC 患者中，包括Cyclin D1（CCND1）和FGF3/4/19基因的CNV显著增强，而在非吸烟者和 LUAD 患者中则相应减少（图5D-F）。CCND1和FGF3/4/19基因的CNV在II期和III/IV期患者之间存在显著差异（图5G）。但是，许多基因的CNV与年龄没有统计学相关性。根据年龄、性别、吸烟、肿瘤亚型和临床分期分组的基因融合率在NSCLC病例中表现出细微差异。总体而言，许多基因的SNV/indel和CNV与NSCLC患者的一些临床病理特征相关，如性别、吸烟、癌症亚型和临床分期相关。
图5.NSCLC队列中基因SNV/indel/CNV/融合与临床特征的相关性
研究结论
这项研究结果表明，结合DNA和RNA测序分析的方法在检测多种类型的驱动基因改变中，有利于增加NSCLC患者靶向治疗的可能性。未来，需要更进一步的研究来验证这种检测结合方法在前瞻性研究中对NSCLC患者靶向治疗选择的临床指导价值。该研究也为未来的临床实践提供了启示，并为进一步的研究提供了方向。
参考文献：
[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209–49.
[2]Ettinger DS, Wood DE, Aisner DL, Akerley W, Bauman JR, Bharat A, et al. Non-small cell lung cancer, version 3.2022, NCCN clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 2022;20(5):497–530.
[3]Kaya C, Dorsaint P, Mercurio S, Campbell AM, Eng KW, Nikiforova MN, et al. Limitations of detecting genetic variants from the RNA sequencing data in tissue and fne-needle aspiration samples. Thyroid. 2021;31(4):589–95.
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