冠状动脉阻塞引起的心肌梗塞（MI）是全球心血管疾病发病率和死亡率的主要原因。心肌细胞（CMs）的大量损失导致有序的心肌组织被瘢痕组织取代，最终破坏了心肌组织的力学性能并损害了电信号的传递。终末分化的CMs的扩张和再生能力有限，导致受损心肌组织无法自我修复和补偿梗死后的心脏收缩功能。
在这种情况下，传统的药物和介入疗法无法为心肌梗死愈合建立合适的微环境，从而逆转损伤的心肌和功能不全的心脏。基于水凝胶的工程心脏贴片 （ECP）已被证明可有效构建修复性微环境，该微环境可以将电和/或机械刺激桥接在梗死心肌上。这有助于防止梗死心脏变薄和扩张，改善心脏功能。得益于生物材料设计中对生物相容性、力学性能和导电性的考虑和优化，ECP能够成功促进心肌修复。
壳聚糖（CS）是最丰富的氨基多糖之一，具有生物相容性和体内可降解性。CS中的游离氨基可以触发阴离子交换，形成离子传导网络。基于碱性离子侵入CS酸性溶液时CS分子的去质子化，构建由有序聚集氢键交联的强CS凝胶网络是可行的。CS水凝胶中的氢键构建可以被设计为程序控制，从而产生稳定的力学性能，满足ECP的稳固性要求。这为构建有效整合生物相容性、力学性能和导电性的ECP提供了可行的方法。
而我们知道，急性心肌缺血会导致心肌细胞内的氧气和营养物质被切断，直接导致线粒体功能障碍，产生大量病理性活性氧（ROS），进而引发心肌细胞凋亡，损害周围血管组织。通过对-lipoic酸（TA）、原花青素（PA）、Eu3+分子特性的利用，本研究构建了一种基于 CS的强稳固性程序控制功能化 ECP（CS/TA@PAs-Eu），用于MI的自适应修复。
图1：低温碱渗透诱导程序化氢键构建CS水凝胶
首先，我们需要构建CS水凝胶。如图1所示，通过对CS分子进行低温间渗透，氧化物离子在低温环境中程序化渗透，在此期间CS分子进行去质子化，借助冰晶模板，通过强大的聚合氢键形成了一个强大的水凝胶网络。其中我们可以看到，由编程氢键构建的CS水凝胶表现出强大的机械鲁棒性，即使在严重折叠或变形后，也可以在水溶液中有效恢复其初始形状。这说明CS水凝胶中的氢键结构可以设计为编程控制，从而实现稳定的机械性能，满足ECP的鲁棒性要求，表现出的良好的自恢复性，非常适合ECP适应连续心跳所需的机械性能，该属性预计将为梗死的心肌提供持久的机械支持。（图1）
图2：功能化CS水凝胶（CS/TA@PAs-Eu）的构建及其在心肌梗死修复中的应用示意图
接下来，在TA热开环效应的帮助下，使用TA构建了聚TA网络，再向其加入PA与Eu3+，其中，PAs分子可以通过氢键锚定CS分子，PAs- Eu 3+功能平台是根据PAs和Eu3+之间的协调交互构建的，从而进一步构建 了CS/TA@PAs-Eu水凝胶 的双网络结构。
我 们知道， 嵌入式聚（ TA ）网络被用来增强 CS 水凝胶的离子传导性，改善梗死心肌的线粒体功能。此外，基于 PAs 对 CS 的交联作用和 PAs 对 Eu 3+ 的螯合作用，进一步建立了具有抗氧化和血管生成特性的修复 MI 的功能平台。所以，在 CS/TA@PAs-Eu 水凝胶替换心脏坏死部分后，体现出了促进血管生成、增强电信号传输、抗氧化以及修复线粒体功能的特性。 （图 2 ）
图3：水凝胶上CM的活/死染色，以及细胞活力的量化基于活死染色图像（比例尺：50 µm，a）；在水凝胶上播种的CM的F-actin染色图像3天和7天，以及基于F-actin染色图像的CMs的单细胞F-actin面积%（比例尺：10 µm，b）；水凝胶上CMs中α-actin（绿色）和CX-43（红色）的心脏特异性蛋白质的表达，以及基于免疫荧光图像（右）对CM中α-actin面积%和CX-43面积%的统计分析（比例尺：10 µm，c）。水凝胶d上CMs中的钙瞬态和相应的频率信号
紧接着，我们评估了水凝胶对CM的可行性和成熟度的影响。 对水凝胶上CM的活/死染色，以及基于死活染色图像的细胞活力的量化，我们发现基于CS的水凝胶表现出良好的细胞相容性，在这些水凝胶上播种的CM保持了高细胞活力（接近100%）。
α -肌动蛋白和连接素-43（CX-43）是CM中的两种重要蛋白质，与同步细胞收缩、CMs成熟和电收缩耦合有关。 如图2c所示，在CS/TA、CS/TA@PA和CS/TA@PAs-Eu水凝胶上播种的CM表现出具有扩散形态的条纹α-actinin。 由α-actinin介导的肉瘤在CMs中表现出更均匀的顺序，与其余水凝胶相比，在CS水凝胶上播种的CM表现出不成熟的外观，没有表现出明显的肉瘤结构。 在所有水凝胶上播种的CMs在细胞膜上表现出CX-43蛋白的均匀分布。 结果表明，功能组件（TA、PA和Eu3+）的结合使CM之间的连接和耦合逐渐改善。
其中高水平的CX-43和α-肌动蛋白被认为是CMs自发收缩特性的表现所必需的。因此，我们对细胞内Ca2+进行了额外的评估，这是影响自发细胞收缩的关键因素。如图3d所示，只有在CS/TA@PAs-Eu水凝胶上播种的CM才能同时出现细胞内Ca2+，这表明功能组件（TA、PA和Eu3+）改善了细胞成熟和功能化。CM之间的电信号桥接是基于CS/TA@PAs-Eu水凝胶的适当导电性实现的。（图3）
图4：a）H2O2，b）·OH，c）O2−，和d）水凝胶的DPPH清除能力；水凝胶对H9C2细胞ATP水平的影响e）；暴露于水凝胶的H9C2细胞中细胞ROS的荧光图像，以及DCFH-DA荧光面积%的统计分析（右）（比例尺：200µm，f）；水凝胶处理对细胞线粒体膜电位的影响，以及JC-1绿色荧光面积%的统计分析（右）（比例尺：50µm，g）
图5：水凝胶对线粒体通透性过渡孔的影响，以及钙黄绿素AM和CoCl2绿色荧光（右）的定量面积百分比（比例尺：50μm）
由上述可知，CS/TA@PAs-Eu水凝胶需要承担抗氧化和线粒体保护的职责，因此，我们评估了水凝胶的抗氧化性能。我们对功能化的CS水凝胶的各种自由基的清除作用进行了评估，发现功能化水凝胶对各种自由基具有良好的清除功能。并使用DCFH-DA荧光探针与细胞内ROS结合并发出绿色荧光，发现细胞内绿色荧光强度随着CS水凝胶的功能化而降低，证实了TA和PA在清除细胞内ROS中的协同作用。（图4a-d、f）
而ROS产生的主要原因是急性缺血诱导的线粒体功能障碍，所以接下来对改善线粒体功能方面进行了评估。我们通过测量H9C2细胞（可替代心肌细胞的体外细胞模型）中ATP水平并且通过使用线粒体膜电位测试来评估水凝胶对线粒体状态的影响。不出所料，功能化的CS水凝胶防止了氧化应激下线粒体膜电位的下降，并抑制了ROS诱导的线粒体通透性过渡孔的打开。从上述结果中可以明显看出，在氧化应激条件下，添加TA有效地增强了水凝胶对线粒体的保护作用。作为参与线粒体能量代谢的酶的重要辅因子，TA可以改善线粒体膜，提高细胞谷胱甘肽和ATP水平。此外，具有抗氧化能力的PA可以在改善线粒体功能方面发挥协同作用。总而言之，这些结果表明，CS/TA@PAs-Eu水凝胶可清除MI微环境中多余的ROS，并改善线粒体功能。（图4eg、图5）
图6：HUVECs的活/死染色和水凝胶处理下的细胞增殖活性（比例尺：100µm，a）；用水凝胶处理的HUVECs的血管管形成图像（比例尺：100µm，b），以及组（e）对总管长度的统计分析；用水凝胶处理的HUVECs的细胞迁移能力0、12和24小时（比例尺：100µm，c），以及划痕面积的统计分析f）；通过CAM分析（比例尺：5mm，d）对水凝胶的血管生成潜力评估，以及血管传播面积g的统计分析
血管重建对于恢复MI部位的营养供应和电信号传输很重要，因此ECP需要具备促进血管重建的功能。 这里我们使用HUVCEC细胞（人脐静脉内皮细胞）对其生存能力进行了研究，发现虽然固定在CS/TA@PAs-Eu水凝胶上的Eu3+占据了一些酚酸羟基，导致水凝胶的抗氧化性能略有下降，但CS/TA@PAs-Eu水凝胶显著改善了HUVECs的管状形成，并表现出最长的管状总长度，且水凝胶中功能成分（TA、PA和Eu3+）的持续释放可以有效匹配HUVEC的迁移，并表现出促进作用，我们知道，血管生成也与细胞迁移密切相关。
为了进一步研究水凝胶对血管重建的效果，我们使用胆囊囊膜CAM检测评估了水凝胶对血管生成的影响。发现所有水凝胶都具有亲血管化，这可以归因于CS的良好生物相容性以及功能成分（TA、PA和Eu3+）的协同效应。这些结果表明，构建的功能平台可以改善梗死心肌的血管化。（图6）
图7：水凝胶移植前后心脏的超声心动图图像a）；水凝胶移植前后左心室功能参数（FS和EF）的变化b，Sham：n=7，MI：n=11，CS：n=14，CS/TA：n=13，CS/TA@PAs：n=12，CS/TA@PAs-Eu：n=14）；不同组心脏切片的Masson三色染色，以及梗死大小和梗塞壁厚度的相应统计分析（右）（比例尺：1毫米，c）
图8：线粒体结构三维TEM图像(比例尺:1μm,a);第3天梗死部位DHE(红色)免疫荧光染色及DHE面积%统计分析(比例尺:50μm,b);梗死心肌中CX-43(红色)和-actinin(绿色)蛋白的免疫荧光染色，CX-43面积%和-actinin面积%(右)的相应统计分析(比例尺:10μm,c);梗死心肌-SMA(绿色)和vWF(红色)蛋白免疫荧光染色，并对-SMA面积%和vWF面积%(右)进行统计分析(比例尺:50μm,d)
图10：移植后第 4 周使用 64通道电极阵列映射系统对不同组的 Langendorff 灌注心脏进行电映射图像，并在梗死部位记录区域场电位电图 （a-e）;基于电映射图像（f）计算纵向传导速度;基于区域场势电图的区域场势振幅（g）
图11：M1表型巨噬细胞和M2表型巨噬细胞（CD86标记的M1表型巨噬细胞，CD206标记的M2表型巨噬细胞，比例尺：50μm）反映的梗死心肌炎症微环境
最后，我们对CS/TA@PAs-Eu水凝胶治疗梗死心肌的效果以及心功能的恢复情况进行了评估。在使用左前降（LAD）方法构建Sprague-Dawley（SD）大鼠M模型后，将水凝胶植入梗死区域，并在4周后评估其修复效果。发现使用CS/TA@PAs-Eu水凝胶治疗的组大鼠梗死后的存活率提高了，并通过超声心动图和心脏射血分数的变化我们可以得到，CS/TA@PAs-Eu水凝胶可以通过增强心脏泵送能力和抑制心室重塑来改善心肌梗死引起的心力衰竭。 （图7 ab、图9）
接下来我们用Masson的三色素染色被评估水凝胶对梗死心肌的形态和病理修复的治疗效果。显示水凝胶治疗抑制了心肌组织纤维化，并表现出对心肌组织修复的积极调解作用，维护效果随着功能组件（TA、PAs和Eu3+）的协同效应而逐渐增加，CS/TA@PAs-Eu水凝胶对梗死心肌表现出最有效的修复效果。（图7c）
MI上CS/TA@PAs-Eu水凝胶的改进归因于MI修复过程中的多级干预。病理性ROS引起的炎症主要源于受损的线粒体，我们通过观察梗死后每组3d梗死心肌部位的线粒体形态变化，发现CS/TA@PAs-Eu水凝胶防止ROS破坏线粒体结构。此外，用DHE染色评估梗死心肌中的·O2−，其中，CS/TA、CS/TA@PAs和CS/TA@PAs-Eu水凝胶处理的梗塞心肌表现出显著较低的DHE水平，这证实TA和PA在早期MI有效地抑制了ROS的产生。（图8a、b）
通过测量CX-43和α-actinin的表达水平，促进了对梗死心肌电收缩耦合的水凝胶处理的评估。与MI组和其他水凝胶处理组相比，CS/TA@PAs-Eu水凝胶组的CX-43和α-actinin的表达水平更高。这证实了其保护心肌组织电收缩耦合和维持心肌电生理功能的能力。此外，电映射系统用于评估孤立的Langendorff灌注心脏中梗死心肌的电生理重建。发现CS/TA@PAs-Eu水凝胶在梗死心脏的电信号传导方面表现出最明显的改善。（图8c、图10）
为了评估水凝胶对梗死心肌恢复氧气和营养供应的影响，进而评估水凝胶抑制心室重塑和改善梗死心肌修复的能力，我们评估了血管生成。内皮细胞（von Willebrand因子，vWF标记）和血管平滑肌细胞（α-平滑肌肌动蛋白，α-SMA标记）的荧光染色显示CS/TA@PAs-Eu组构建了最广泛的血管网络，并有效地促进了MI修复。然而心肌病通常伴有组织坏死和炎症细胞浸润。其中，M1表型巨噬细胞通过分泌促炎因子促进纤维化，而M2表型巨噬细胞通过分泌抗炎因子来抑制纤维化，这分别反映了梗死细胞的恶化和改善。结果表明，功能化的CS水凝胶可以通过调节巨噬细胞极化到M2巨噬细胞来抑制纤维化。（图8d、图11）
基于上述情况，我们认为CS/TA@PAs-Eu水凝胶具有多方面的功能，包括提供机械支持，促进贯穿梗死心肌的电传导，以及促进整合效应，如清除ROS，改善线粒体功能，促进血管增生。
总结：
结果表明，CS/TA@PAs-Eu水凝胶的生物相容性和电导电性促进了CM的成熟和功能化。此外，CS/TA@PAs-Eu水凝胶改善了氧化应激下H9C2细胞中的ATP水平、线粒体膜电位和线粒体渗透性过渡孔隙。此外，CS/TA@PAs-Eu水凝胶表现出有效的抗氧化和血管生成特性。最后，CS/TA@PAs-Eu水凝胶通过抑制左室重塑和恢复心脏功能表现出对心肌的自适应性修复。这些包括改善线粒体功能、抗氧化、电生理重建和亲血管化。
综上所述，通过程序化氢键构建的CS水凝胶的骨架网络表现出生物安全性和机械稳定性，适用于ECP构建。随着功能性TA、PA和Eu3+的结合，它表现出清除ROS、改善线粒体功能和促进血管化的能力。结果表明，CS/TA@PAs-Eu水凝胶为MI修复提供了一个有意义的平台，并在临床实践中具有潜在的应用。
参考文献
Z. Li, Q. Li, W. Cao, J. Zhan, Y. He, X. Xing, C. Ding, L. Wang, X. Qiu, A Strongly Robust Chitosan-Based Programmed Control Functional Hydrogel Improved Mitochondrial Function and Pro-Vascularization for Adaptive Repair of Myocardial Infarction. Adv. Funct. Mater. 2024, 34, 2312631. https://doi.org/10.1002/adfm.202312631
来源：仿生材料与界面组织工程