近日由来自上海交通大学医学院公共卫生学院的Daoxia Guo，Xiaoyuan Ji，Hui Wang，Haiyun Song以及来自上海交通大学化学化工学院的Chunhai Fan等多名研究人员在Adv Mater期刊（IF=29.4）上，共同发表了题为“Targeted Reprogramming of Vitamin B3 Metabolism as a Nanotherapeutic Strategy towards Chemoresistant Cancers”的文章，在该文章中，研究人员设计了类似于Gemini的纳米粒子（NPs），通过包裹AbMole的Sulforaphane(SFN，M3988)，并进行水凝胶介导的靶向癌症相关成纤维细胞（CAFs）和癌细胞的NPs共同递送，从而证实该NPs对耐化疗肿瘤的广泛适用性，为开发广泛适用于癌症化疗抗性的给药方式提供了新方法。
化疗耐药性和免疫无反应性是癌症化疗和免疫研究都在面临的问题。CAFs能维持癌症干细胞（CSC）的干性并使其不分化，并且能通过产生大量的生态位相关因子，招募MDSCs和Treg细胞，建立免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。然而，直接消除CAFs可能会促进癌症的侵袭和转移。在本研究中，研究人员通过构建装载有针对烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）的siRNA并涂有CAF膜的NPs，从而解决了这种问题。
研究人员以介孔二氧化硅（MSN）为核心构建了两种类Gemini NPs，分别针对CAFs转化和癌细胞消除，并同时载入TME响应性水凝胶中。其中，siNNMT-CAF（靶向CAFs的NPs）涂有CAF膜，用于传递NNMT短干扰RNA，而Chemo-CC（癌细胞靶向NPs）被伪装成同型癌细胞膜，用于传递相关的一线化疗物质（图1）。
图 1 共同递送CAFs和癌细胞靶向NPs的水凝胶平台设计示意图
之后通过实验评估加入siNNMT-CAF后CAFs的代谢变化，发现siNNMT-CAF可以下调NNMT的水平，并恢复细胞中的SAM和NAD+，表明这种纳米试剂可以恢复正常的维生素B3代谢和甲基供体库（图2A，B）。再通过免疫印迹分析，以及监测CAFs中促癌细胞因子和趋化因子的表达，发现siNNMT-CAF可以通过一系列的代谢和表观遗传重塑，诱导CAFs转变为静止的成纤维细胞。
图 2 A-B. 细胞中SAM（A）和NAD+（B）的含量。
接下来研究人员将类Gemini NPs载入水凝胶中（siNNMT-CAF/EBN-4T1@Gel），并对NPs的释放曲线和在肿瘤组织中的保留时间进行研究，发现水凝胶递送的NPs可以延长siNNMTFAM或EBN保留在肿瘤中的时间（图3A，B）。并且经肿瘤切片的免疫染色分析显示，同源细胞膜包被能促进α-SMA+CAFs和CD44+4T1肿瘤细胞分别对siNNMTFAM-CAF和EBN-4T1的内化（图3C，D）。这些数据表明，将类Gemini NPs封装在对ROS敏感的水凝胶平台中，可以延长物质在TME中的保留时间，并促进针对特异性细胞类型的递送。
图 3 A-B. 水凝胶递送siNNMTFAM-CAF（A）或EBN-4T1（B）在第0天（D0）、第3天（D3）和第10天（D10）的共聚焦荧光成像和肿瘤内含量的量化。C-D. NPs的瘤内分布。(C)施用siNNMTFAM-MSNs、siNNMTFAM-MSN@Gel或siNNMTFAM-CAF@Gel后肿瘤切片的共聚焦荧光成像和定量。(D）使用EBN-MSNs、EBN-MSN@Gel或EBN-4T1@Gel后肿瘤切片的共聚焦荧光成像和定量。
此外，研究人员还评估了siNNMT-CAF@Gel在耐化疗的4T1三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型中的作用效果。发现使用siNNMT-CAF能明显减少CAFs标志物以及CAFs分泌的促癌细胞因子和趋化因子的产生（图4A）。并且还观察到肿瘤组织中CSCs、MDSCs和Treg细胞的丰度明显下降（图4B-D）。同时，免疫抑制细胞群的减少会导致TME中CD45+CD8+ T细胞的浸润增加（图4E）。说明siNNMT-CAF@Gel对TME的重塑能促进CSCs的分化和免疫激活，并恢复肿瘤细胞对化疗物质和宿主免疫监视的敏感性。
图 4 A. 用PBS、siCtrl-CAF@Gel或siNNMT-CAF@Gel处理肿瘤后CAFs中NNMT、α-SMA、FAP-α、IL6、IL8、CXCL1、CCL2、CCL5和CXCL12表达的Q-PCR分析。B. 化疗耐药TNBC经指定处理后的CSC比率。C-E. 指定处理后（C）MDSCs（CD45+细胞群）、（D）Treg细胞（CD45+CD4+细胞群）和（E）CD8+T细胞（CD45+细胞群）的比例。
之后，研究人员比较同时使用NPs（siNNMT-CAF/EBN-4T1@Gel）联合给药，以及单独使用一种NPs的效果差异，发现单独使用siNNMT-CAF@Gel或EBN-4T1@Gel处理的癌细胞信号略有减少，而联合处理组的信号逐渐消失（图5A）。且联合给药组的所有小鼠都痊愈，同时没有肿瘤复发或转移的迹象（图5B）。提示类Gemini NPs能通过对CAFs和肿瘤细胞的协调靶向调控，从而达到更好的抗肿瘤效果。
图5 A. 小鼠在接受指定处理后的体内生物发光成像。B. 生存曲线。
接下来，研究人员在给予单剂量siNNMT-CAF/EBN-4T1@Gel两个月后，对治愈的小鼠进行二次肿瘤接种（图6A）。发现所有野生小鼠在接种4T1细胞后肿瘤生长快速，而愈合小鼠中只有一半在30天的时间内形成肿瘤，且生物发光信号减弱，生长明显延迟（图6B，C）。说明使用单剂量联合给药的类Gemini NPs能提供长期的保护性免疫，并可产生对二次肿瘤接种的强烈排斥。
图6 A. siNNMT-CAF/EBN-4T1@Gel治愈小鼠（给药组）肿瘤再接种的实验设计。年龄匹配的野生小鼠作为对照组（Naive）。B. 4T1肿瘤细胞再接种之前（第66天）和之后（第72、82、97天）小鼠体内生物发光成像。C. 肿瘤生长曲线。饼图表示小鼠肿瘤生长（红色）和排斥反应（蓝色）的比例。
随后又进一步分析肿瘤再接种后脾脏中的中央记忆T（Tcm）细胞和肿瘤中浸润T细胞的水平，发现与野生小鼠相比，经siNNMT-CAF/EBN-4T1@Gel处理治愈的小鼠中CD8+和CD4+Tcm细胞的比例明显增加（图7A），并且可以招募更多的肿瘤浸润性CD8+和CD4+T细胞（图7B）。说明类Gemini NPs可以高效诱导T细胞记忆，并能对肿瘤再挑战作出持久和有效的召回反应。
图 7 A. 左图和中图：CD4+（上）和CD8+（下）Tcm细胞用FlowJo软件在t-SNE图谱中可视化。右图：总脾细胞中CD4+和CD8+Tcm细胞（以CD45+细胞为门控）的比例。B. 野生小鼠和给药小鼠肿瘤浸润免疫细胞中CD8+T细胞的t-SNE图谱可视化和量化。
最后，研究人员在另外三种类型的化疗耐药肿瘤模型（即耐SFN的HCC、耐GEM的PADC和耐5-FU的CRC）中，验证对耐化疗肿瘤的广泛适用性，并且均观察到肿瘤抑制和生存期延长的效果，说明在CAFs和癌细胞中共同递送类Gemini NPs进行协调调控，可以作为克服化疗抗性肿瘤的普遍策略。
该研究使用了AbMole Sulforaphane(SFN，M3988)，是一种天然产物，同时也是组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的抑制剂。
研究人员通过使用SFN反复处理患H22肝细胞癌（HCC）的小鼠，从而获得化疗抗性模型。在成功诱导化疗耐药后，在肿瘤中可观
察到CSC（CD44+CD133+）群体的明显增加（图8A，B）。随后研究人员构建癌细胞靶向NPs（即SFN-H22（SFN-MSN@H22细胞膜））用于靶向输送相关的化疗药物，并将SFN-H22与siNNMT-CAF共同递送，用于联合给药。
图 8 A-B. 慢性SFN诱导化疗耐药的HCC。经过指定处理后肿瘤中CD44+CD133+CSCs的(A）FACS分析和（B）定量。H22肿瘤小鼠腹腔注射SFN（37.5 mg/kg），每隔一天一次，持续一个月。
接下来，通过监测单剂量的类Gemini NPs在该化疗抗性肿瘤模型中的作用效果，研究人员发现，在对SFN耐药的HCC中，肿瘤的生长不会被未载药的Gel或游离的siNNMT/SFN影响，但会受到siNNMT-CAF@Gel或SFN-H22@Gel的轻微抑制，并且联合给药siNNMT-CAF/SFN-H22@Gel可以彻底根除肿瘤（图9A，C）。此外，对照组和单药组的小鼠在癌细胞接种后48天内均死亡，而接受联合给药的小鼠在观察窗口内全部存活（图9B）。这些数据共同证明水凝胶递送NPs的优势，以及在CAFs和癌细胞中共同递送类Gemini NPs进行协调调控的作用效果，提示类Gemini NPs可以作为克服化疗抗性肿瘤的普遍策略。
图9 A. 平均肿瘤生长曲线。B. 生存曲线。C. SFN耐药的HCC在指定处理后的个体肿瘤生长动力学情况。
综上所述，研究人员设计了类Gemini NPs，并发现共同递送经水凝胶介导的靶向CAFs和癌细胞的NPs，可以根除肿瘤的生长，同时能产生对肿瘤再挑战的长期保护性免疫力。这些发现为开发广泛适用于癌症化疗抗性的方法提供了一种可行策略。
鸣谢：Guo, Daoxia et al. Adv Mater. 2023 Jun 1:e2301257.