1867年7月的一天，负责保护京都治安的京都“活跃”团体新选组得到了来自于京都所司代的情报，情报指出在真町的一名叫做俞屋喜右卫门的商人有不小的问题，原因是这人有一间十分寒酸的出售木柴煤炭和生活器具的店铺。按说这只是一家不起眼的小店铺，可是这间店铺却经常迎来大量的浪人，而且这些浪人也不购买任何东西，空手进去又空手出来。这种不合理的情况导致了京都所司代怀疑，因此京都所司代要求新选组调查此人。
事实上，新选组也注意这人有段时间了，从6月份开始就一直监视着他，如今京都所司代发话，那正好将其一鼓作气擒拿。新选组的副领袖土方岁三当机立断，命令一批队士去秘密捉拿俞屋喜右卫门。临行前土方岁三反复叮嘱队士，必须秘密逮捕俞屋喜右卫门，否则动静太大的话，可能俞屋喜右卫门的同伙就会闻讯而逃，那样的话也就无从谈起破获对方的阴谋了。
新选组平日负责京都治安，在诸多队伍中是表现最为出色的，抓捕区区一个俞屋喜右卫门何足道哉，7月8日，新选组秘密逮捕了俞屋喜右卫门，将其带回到了新选组的屯所审讯。因为这个俞屋喜右卫门的嘴巴太硬，所以新选组土方岁三亲自审讯了俞屋喜右卫门。按照新选组队士在事后的说法，土方岁三下手十分凶残，把俞屋喜右卫门打得几乎是不成人形，就算是新选组里最勇猛的队士也不敢直视土方岁三的审讯现场，可谓之“观者为止侧目，队士亦不敢逼视”。
俞屋喜右卫门经不住土方岁三的严刑拷打，只能把自己知道的全都招了。俞屋喜右卫门表示自己本名叫做古高俊太郎，是长州藩派到京都来的一名间谍，他的任务就是充当长州藩在京都的眼线。同时他还招供了一个惊天阴谋——长州藩计划趁祇园祭会的机会，在京都城内四处纵火，以此乱人耳目的同时攻入皇宫内部，趁机杀死幕府大佬如一桥庆喜和松平容保等人，并且要劫持天皇去长州藩。
此话一出真是把土方岁三惊出一身冷汗，急忙去联系新选组领袖近藤勇，二人稍一合计后，决定立刻展开行动，一面去联系会津藩和桑名藩，请他们出兵搜捕长州藩的乱党贼子，一方面组织新选组成员，准备在贼人最有可能藏身的地方动手抓人。不过因为会津藩和桑名藩行动迟缓，因此夜间只有新选组自己集结了现有的人手去进行搜捕。
当时新选组的大部分队士都有任务而不在屯所了，所以在新选组集结人力之后，也仅仅凑出了34人而已。考虑到新选组现在的人力严重不足，所以土方岁三带23名队士搜索范围较大的八坂神社一带，而近藤勇则带着包括藤堂平助、永仓新八、冲田总司等新选组高手在内的九名队士搜索三条大桥一带。
土方岁三搜索的方向并没有长州藩乱党藏身，反倒是人数较少的近藤勇在旅馆“池田屋”发现了长州藩乱党。近藤勇命五名队士四散包围池田屋，自己亲率藤堂平助、永仓新八、冲田总司等四人冲进池田屋，和长州藩乱党拼杀了起来。当时池田屋里有长州藩乱党数十人，人数对近藤勇等人有绝对的优势地位，可近藤勇因为听闻长州藩的攘夷派核心人物“桂小五郎”（木户孝允）也在此处，所以脑一热就带人突击池田屋二楼，希望一举斩杀桂小五郎。
近藤勇所率领的都是新选组里的高手，论及个人战力绝对是强于长州藩乱党，奈何长州藩乱党人数占据优势，所以在对方的围攻之下，近藤勇等人很快就被飞散了，等到近藤勇杀上二楼欲寻找桂小五郎时，身边也就剩下一个冲田总司了。而楼下的藤堂平助和永仓新八虽然很想去支援近藤勇，可是他们现在也是被多人围着砍的状态，根本无力去脱身赶往二楼，只能在一楼苦苦支撑。
危急时刻，土方岁三终于带着援兵赶到了池田屋，双方的人数优势瞬间逆转，随着土方岁三等人加入战局，池田屋里的长州藩乱党终于支撑不住了，长州藩乱党有七人被杀，十一人重伤，另有十余人被擒，剩下的则趁乱逃出了池田屋。新选组方面则损失轻微，总计只有两人重伤不治身亡，另有冲田总司肺痨发作而卧床不起。但不管怎么样，长州藩火烧京都的阴谋也被破获，不然的话京都这座千年古都，可能就被叛军烧成白地了，而新选组也因此池田屋事件而名扬京都，成为京都重要的治安力量。