近期，清华大学丁强团队联合复旦大学张荣和袁正宏团队在PNAS上正式发表了题为“Functional and Genetic Analysis of Viral Receptor ACE2 Orthologs Reveals Broad Potential Host Range of SARS-CoV-2”的研究论文。研究基于SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白和宿主ACE2相互作用的结构基础，在脊椎动物发现约80个物种（均为哺乳动物）的ACE2可能作为SARS-CoV-2进入宿主细胞的功能性受体。
通过基因遗传学分析，研究人员选取了48个代表性物种（48/80）进行功能性分析，结果发现有44种哺乳动物（包括家畜、宠物以及动物园或水族馆中的动物）的ACE2可以与S蛋白结合，促使SARS-CoV-2进入靶细胞，而新大陆猴以及考拉ACE2同源基因不能结合S蛋白并支持病毒进入宿主。该研究表明SARS-CoV-2可能具有广泛的宿主范围，提示监测易感宿主的重要性。此外，禁止非法买卖野生动物交易，警惕SARS-CoV-2跨物种传播对于防止未来的疫情再爆发十分重要。
对于SARS-CoV和SARS-CoV-2来说，其S蛋白的RBD识别宿主细胞表面受体ACE2的过程是宿主范围、组织嗜性和发病机制的主要决定因素。ACE2在绝大多数脊椎动物中均有表达，但很多动物并不会被感染，如小鼠、大鼠。虽然已有实验证据显示，仓鼠、雪貂、猫、狗以及一些非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）可以被SARS-CoV-2感染，但SARS-CoV-2的确切宿主范围仍然不得而知。
研究人员首先根据SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2的结构基础，确定了5个高度保守的关键氨基酸残基，这些氨基酸对于S蛋白介导的病毒进入至关重要。根据这5个氨基酸残基的保守性，从 NCBI数据库中对已有的294个ACE2同源序列进行分析，筛选出了80个来自哺乳动物的 ACE2同源基因可能具有病毒受体活性。进一步遗传学分析表明，在狭鼻下目（包括人型总科和旧世界猴子）中，ACE2与S蛋白相互作用表面的20个氨基酸残基高度保守，而新世界猴子中则相对不保守，如人ACE2中的Y41和Q42被H和E取代，不能形成氢键。此外，在非灵长类动物中，氨基酸替代明显增加。
▲ ACE2高度同源物种的进化和系统发育分析
接下来，研究人员选择了48个具有代表性的ACE2同源序列，这些动物主要包括野生动物、动物园和水族馆中的动物、与人密切接触的宠物和牲畜以及生物医学研究中的模型动物等，涵盖灵长目（猿类等）、啮齿目（鼠类等）、偶蹄目和奇蹄目（家畜等）、翼手目（蝙蝠等）、双门齿目（袋鼠、考拉等）、食肉目（老虎、狮子等）、鳞甲目（穿山甲等），将其cDNA克隆到慢病毒载体（pLVX-IRES- zsGreen1）中，在HeLa细胞中表达通过测定ACE2和病毒S蛋白的结合以及感染SARS-CoV-2来评估其作为受体介导病毒感染的能力。
将Fc和SARS-CoV-2的S1融合蛋白与过表达带有绿色荧光报告基因的不同物种ACE2的HeLa细胞共孵育，通过流式细胞术检测绿色荧光中S1蛋白阳性的百分比，来评估结合能力。结果显示，阳性对照人ACE2和阴性对照小鼠ACE2都和预期一致。三种新世界猴子（白色簇绒耳狨猴、松鼠猴和簇毛捲尾猴）以及考拉ACE2不结合S1蛋白，雪貂和水貂 ACE2结合能力比较有限，其余的ACE2都可以很好的与S1蛋白结合。以上结果表明，很多物种的ACE2蛋白均可以与SARS-CoV-2的S蛋白相互作用，可能具有介导病毒进入的功能。
▲ SARS-CoV-2 S蛋白与不同物种ACE2结合实验
为了直接测定ACE2介导病毒进入细胞的功能，研究人员直接用 SARS-CoV-2活病毒感染过表达ACE2的HeLa细胞，48h后对病毒N蛋白进行免疫荧光染色。结果与上述S1蛋白与ACE2的结合能力基本一致，44个物种的ACE2过表达的HeLa细胞中均检测到了大量的N蛋白阳性信号。而过表达三种新世界猴子和考拉ACE2的细胞中未检测到信号，过表达雪貂和水貂ACE2的细胞则检测到较低的信号。该结果表明SARS-CoV-2可以利用进化多样化的哺乳动物ACE2作为病毒进入细胞的受体，揭示SARS-CoV-2可能具有广泛的宿主范围。
▲ 介导SARS-CoV-2病毒进入体内的ACE2高度同源物种的功能评估
另外，该研究还提示虽然ACE2在这些物种间整体保守（71%-100%），但保守程度与支持病毒进入的功能不直接相关。例如以上三种不能介导病毒进入的新世界猴子ACE2序列与人ACE2序列的同一性在92%-93%之间，而有效介导病毒进入的猪和牛ACE2序列与人ACE2序列同一性分别为81%和78%。基于此，研究人员合理推测，新世界猴子中的ACE2蛋白某些关键的氨基酸残基替代，限制了病毒的进入。新世界猴子也是一种生物医学研究常用的非人灵长类动物模型，最近的一项体内研究也表明SARS-CoV-2可以感染旧世界猴子（恒河猴和食蟹猴）而不能感染新世界猴子（狨）。
为了寻找新世界猴子ACE2中限制SARS-CoV-2进入的原因，研究人员分析了ACE2与S蛋白接触位点，特别是可以与S蛋白形成氢键或盐桥的几个重要位点。通过与其他物种ACE2蛋白比对，发现新世界猴子ACE2的唯一差异是H41和E42，其他物种ACE2则是Y41和Q42。而41位和42位这两个连续突变很有可能会破坏原有的氢键相互作用，进而损坏了新世界猴子ACE2与SARS-CoV-2的S蛋白的结合。后续研究人员将通过实验进一步证明这两个位点的重要性。
▲ 鉴定限制SARS-CoV-2进入ACE2物种的特异性遗传决定因素
综上所述，本研究首次使用SARS-CoV-2活病毒对48个哺乳动物宿主的ACE2蛋白进行功能评估，发现了宠物（如猫和狗）、牲畜（如牛、兔、羊、马）、动物园或水族馆的一些动物以及一些野生动物可能作为SARS-CoV-2的潜在宿主，提示在与人密切接触的动物方面要引起警惕，在野生动物方面更要禁止非法贸易以降低接触风险。
值得注意的是，由于条件限制，未能开展SARS-CoV-2感染的动物实验。虽然细胞水平实验具有一定的局限性，不能充分反映体内复杂的免疫过程。但本研究的证据与目前发现的动物实验证据或感染案例基本相互印证（如人、猴子（恒河猴和食蟹猴）、穿山甲、仓鼠、雪貂、猫、老虎、狮子、狗可以感染；而小鼠、新世界猴子（狨）不能感染）。所以本研究仍然为潜在的宿主范围和跨物种传播提供了新的见解，此外，研究人员还强调了监测易感宿主的必要性，有助于防止未来的疫情发展。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33658332/