近年来，在人类多能干细胞(HPSCs）分化的可靠程序的开发方面取得了相当大的进展。朝着这个方向迈出的重要一步也是类器官的衍生。这项技术通常依赖于传统的三维培养技术，这些技术利用hPSC的细胞自主自组织反应，对提供给系统的外部输入进行最小限度的控制。
干细胞生物学和生物工程的融合提供了以可控的方式提供这些刺激的可能性，导致了自然激发的方法的发展，以克服这项新兴技术的主要限制。基于目前的发展，我们强调了将hPSC器官分化、生物工程和伦理学结合在一起的成就和持续的挑战。
这篇综述强调了需要提供工程解决方案，以获得对hPSC衍生器官的自组织和功能的控制。我们期望这些知识将指导社区产生更高级别的hPSC衍生器官，以进一步应用于发育生物学、药物筛选、疾病建模和个性化医学。
在过去的二十年里，干细胞研究通过利用成体干细胞(ASCs）和多能干细胞（PSCs）的自组织特性，促进了我们对器官发生的关键方面的理解。这些进展导致了细胞培养程序的发展，以根据需要产生微型和微器官样的结构，即所谓的类器官。与此同时，生物工程领域的出现导致了技术进步，允许适当的指导性环境（物理和化学），增强细胞对在这些微型器官样结构中形成器官特异性多细胞结构的反应。
目前的方法依赖于传统的三维(3D)培养技术，该技术利用了人类PSCs的细胞自主自组织(HPSCs）（图1)。尽管如此，hPSC衍生的类器官仍然存在一些不足之处。这些问题包括缺乏重复性；在细胞类型组成方面缺乏特异性：大小失控，形状异质性；缺乏适当的血管、免疫和神经成分以及器官特有的形态特征以及缺乏功能性。因此，器官技术目前的主要目标是提高类器官的细胞和形态的复杂性（例如，通过诱导脑器官中组织合理的区域特性，或在肾脏器官中提供一个发展中的分支收集管道系统），提供可灌流的血管网络（促进器官的分化和寿命，但也促进器官到器官的连接，以研究不同组织类型之间的复杂相互作用），以及促进类器官的成熟，以实现相关的组织特异性功能。
图1|hPSC衍生器官工程研究进展
在这篇综述中，作者团队首先回顾了类器官技术的历史渊源，以及3D细胞培养系统的早期发展是如何利用hPSC的自组织能力来产生这些强大的平台的。将共同研究如何应用类器官力学和转录学的最新知识来进一步控制hPSC衍生的类器官的排列、功能和组成。然后，其预见了工程方法（即仿生水凝胶、3D生物打印和微技术）在未来几年克服目前hPSC衍生有机物挑战的直接影响。最后，讨论伦理学家、工程师和干细胞生物学家如何在工程伦理方面进行合作，以及这种共同努力将如何有利于整个hpsc衍生器官领域的成功。
器官历史中三维培养的演变。自20世纪以来，发育生物学家选择了不同的模式生物来研究组织和器官发育过程中的形态发生过程，包括海绵、两栖动物、雏鸟和小鼠。所有这些不同的系统都为解决该领域长期存在的关键问题做出了重大贡献。上个世纪头几十年在这些生物体中进行的开创性观察突出了组织遵循预定发育和功能程序的内在能力，以及这些能力如何决定了细胞在重新聚集过程中的相互和排他关系。
到了20世纪40年代，不同的研究人员证明，从鸟类肢体雏形中取出的生长组织在体外和卵子中会重新排列和形状。此外，在培养中，解体和重新聚集的鸡胚肾脏成为被间充质来源的基质包围的合适的肾上皮管。这些实验精确地指出，细胞重新聚集可以导致组织状结构的自我重组，从而使细胞自动组织成预先图案化的结构。
随着3D培养知识的进步，人们致力于探索细胞外基质(ECM)如何在广泛的细胞培养中决定形态发生和功能。后来，Hans Clevers及其同事应用这一知识，在特定培养条件下培养了嵌入Matrigel中的Lgr5+小鼠肠道干细胞的单细胞悬浮液，成功地生成了具有隐窝绒毛结构的肠道器官。这项开创性的研究和其他研究促进了ASC衍生器官的发展，如胃、胰腺、结肠、前列腺和肝脏。
提高复杂性的生物工程策略。HPSc类器官的产生主要依赖于自组织原理，对提供给系统的外部输入的控制最小。同时，这些过程的不可控性质导致了目前观察到的器官系统的高度异质性，这导致不同实验室之间hPSC分化的重复性较低，不同hPSC系之间分化结果的差异性，以及实验间的差异。由两种化学物质呈现的工程控制的微环境、物理指令代表了实现这些线索可编程性的合理途径，以便更好地控制器官的自组织和分化。
工程自组织。在众多的发育过程中，相关的形态来源和物理线索的梯度不断地帮助建立在活体中出现的结构的极性和多样性。以同样的方式，在自组织类器官系统中，连续的局部微环境改变迅速促进复杂细胞模式的出现，进一步推动体外类器官的形态发生。然而，控制自组织器官中的这些形态发生过程只能通过在系统外部施加生化和生物物理边界来实现。因此，控制初始细胞密度、细胞聚集体的几何形状和大小、细胞-ECM相互作用和生化梯度的工程方法将为hPSC衍生器官的产生提供更准确的指导。相反，当目标是改变发展道路以实现不同的结果时，也可以利用这些战略。
微图案化技术已被用于通过在培养基质中创建具有限定几何形状和大小的受限2D图案来控制物理边界条件。使用这种2D方法，在BMP4存在的情况下，hPSCs在有限的圆形模式下培养，产生来自不同胚层的同心模式的细胞，即所谓的人类胃泌素。类似地，心脏微组织也可以通过以圆形模式种植hPSCs来重复诱导。这些研究表明，生物化学线索和生物物理细胞限制之间的协同作用，对于引导细胞命运反应，紧密依赖于图案几何形状和大小（图2A)。
图2|引导hPSC衍生器官自组织的工程方法
在体内，细胞外基质动力学可以勾画出引导组织形态发生的组织边界。例如，细胞外基质重塑已被证明在分支形态发生过程中发挥重要作用，这是一个关键的发育过程，决定着肺、肾（输尿管芽）、乳腺和唾液腺（颌下腺）等器官的功能结构。虽然ECM的机械特性决定了细胞的行为，如增殖和分化，但只有少数研究探索了使用模拟体内ECM的合成材料来指导hPSC衍生的器官的形成（图2B，C)。值得注意的是，虽然大多数天然ECM是非线性和粘弹性的，但许多合成矩阵不是。这些特征及其对器官自组织的影响仍在研究中。
转录学和组织力学。类器官技术与新兴的转录学和组织力学技术的融合为研究人类发育和组织形态发生提供了前所未有的机遇，并为个性化和精确的医学应用提供了新的前景。到目前为止，大多数类器官（和器官）在分化过程中都被批量绘制了轮廓或进行了测序，但该领域正在迅速向更深入地了解类器官（和器官）的细胞组成前进。此外，器官特定数据集的可用性增加，再加上机器学习算法（即人工智能）的使用，使得预测精度成为可能在细胞器中存在的细胞类型的统一性评分。
这种算法的一个例子是KeyGenes，它已经被用来预测肾脏器官类物质与人类胚胎肾脏的接近程度，显示出随着时间的推移向中期妊娠肾脏的分化进程。体内每个发育转变所需的分子信号通路和组织特异性转录因子的动态正在被揭示。与此同时，还在开发其他技术，以便在全基因组信息的基础上整合位置信息，如原位测序和高多重成像质谱。这些新技术将有助于将位置信息与细胞内的细胞特征和状态联系起来。当在器官形成过程中的不同时间点使用这些程序时，这些程序有可能为器官内的每个细胞定义一个生化特征。此外，在器官个体发育过程中评估环境或遗传操作前的差异反应对于捕捉疾病表型也是重要的（图3)。
图3|整合新兴技术以了解组织形态发生
在体内，遗传程序和多种微环境线索的复杂组合指导着发育过程中组织和器官的形成。这些相互作用控制着一系列机械过程，如变形、重塑和流动，最终形成器官。目前对形态发生机制的理解在很大程度上是通过自上而下的方法获得的，由此导致形状变化的机制可以被解构。虽然这些方法的相关性是显而易见的，但就成像和机械力化学操作而言，使用胚胎的缺点是可获得性有限。
相反，hPSC衍生器官代表了一种负担得起的体外模型，用于评估人类组织形态发生的力学方面以及这些过程在疾病期间的影响。在开发探测器观力学的工具的同时，支持力学测量以预测和指导形态发生的计算工具和模型的进步是至关重要的。到目前为止，已经开发了不同的模型系统来解释扁平上皮单分子层的动力学，包括晶格模型、相场模型、活性网络模型、粒子模型和连续介质模型。它们在三维方面的应用已经取得了一些成功。事实上，就在最近，卡尔兹布伦和他的同事们探索了一种类似的方法来模拟人类大脑器官体外发育和自组织过程中皱纹外观的折叠物理过程（图3)。
总体而言，器官内细胞的转录信息和机械信号在时间和空间上的耦合将为研究人类发育和疾病过程中有机物质的动力学和组织功能的出现以及对不同环境刺激或遗传操作的响应提供精确的描述。
提高成熟度和功能的生物工程策略。目前的类器官方法已经允许形成寿命和功能有限的相对复杂的组织状结构。重要的是，使用患者特定的IPSCs 或通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑在方正hPSCs 中或在器官分化的时间过程中耦合这些方法的可能性已经开始显示这些系统在疾病建模应用中的实用性。这些系统的最终实现推动了工程方法的发展，以提供必要的营养和气体交换需求，以允许增加尺寸、寿命、复杂性和成熟度。虽然这些策略可以提供从有机物生成更大规模组织的可能性，但它也可以允许不同类型的组织连接，例如通过嵌入血管系统。
在大多数有机培养系统中，养分和气体交换是通过培养被动扩散来实现的。为了解决营养和气体供应不足的问题，一些研究在连续搅拌下或旋转生物反应器中培养类器官。在设想器官血管化策略时，一个重要的问题是如何产生器官特异性内皮细胞，这些细胞能够正确地组织和组装，形成支持器官功能的器官特异性血管。
在免疫缺陷小鼠体内，hPSC来源的脑器官、肝芽或肾器官的体内血管化（宿主来源的血管化）已经部分实现。在一种不同的方法中，hPSC衍生的肾脏器官被植入到鸡的CAM上，显示宿主血管化，但也形成了毛细血管环状肾小球样结构，人类来源的内皮细胞与足细胞样细胞密切接触（图4A)。总之，这些发现表明，移植后功能性血管网络的形成可能需要微环境的协同调节，以及宿主血管系统和植入的hPSC衍生器官中存在的内皮承诺细胞（PRE)之间形成适当的相互作用。这最后一点可能会被证明在内胚层和外胚层hPSC衍生的器官中既是必要的，也是具有高度挑战性的，因为在分化开始时，内源性的替代间充质命运（即内皮细胞）的形成很少或完全缺失。
图4|hPSC衍生的器官血管化工程策略。
使用微流控系统来设计血管化是体内移植方法的另一种选择。在体外，微血管是通过将内皮细胞包裹在水凝胶中形成的，水凝胶被引入微流控设备，自组装成可灌流的血管网络。这一方法已经被进一步探索，以创建血脑屏障（图4B)、肿瘤血管生成和肿瘤细胞外渗的模型。
在发育过程中，器官的形状受到来自邻近发育组织的生化和生物物理信号的调节。这些复杂的组织-组织相互作用可以在体外通过器官的空间预构图和各种3D共培养方法来模拟。西村龙一（Ryuichi Nishinakamura)团队开创了小鼠PSC来源的输尿管芽祖细胞和肾单位祖细胞的代代，这些细胞与分离的小鼠基质细胞进一步手工组装在一起，产生模仿胚胎肾脏器官型结构的肾脏器官。
将来，在基质细胞存在的情况下，通过3D生物打印将天然的或PSC来源的分支上皮整合到发育中的肾脏器官中，可能是一种经济合理的方法来精确定位这些不同的成分，这样分支上皮就可以在肾脏器官分化过程中作为组织几何的组织者。在类似的方法中，使用以不同的致力于细胞的祖细胞为起点，Takebe及其同事实现了肝芽的衍生。其他可能受益于3D生物打印应用的有机系统是那些需要来自不同胚胎谱系的细胞相互作用的系统。最近的一个例子是具有功能性肠道神经系统的肠道组织的产生（图5)。
图5|设计组织-组织相互作用的方法。
在另一项研究中，Birey和他的同事通过体外3D组装来自hPSC的预分化的背侧和腹侧前脑球体来模拟大脑区域间的相互作用，这些球体被称为“脑集合体”，事实证明，这重现了在胎儿前脑中观察到的中间神经元的跳跃式迁移。重要的是，当一种名为Timothy综合征的神经发育障碍被用这种装配系统建模时，这种功能特征是不正常的。遵循类似的方法，Takebe和他的同事在vitro中重述了人类肝-胆-胰组织边界（图5)。
总体而言，这些方法需要进一步优化，以实现适当的细胞到器官和器官到器官的整合，并有能力将体内发育和生长概括为更复杂和更有功能的组织结构。
尽管类器官工程领域取得了快速的进展，但由于缺乏实验和概念上的有器官力学途径，面临着长期的挑战。再加上具有良好可调和可控生物物理特性的设计基质的开发，所有这些进展对于提供适当的生理信号来驱动干细胞自组织和构图而不限制后来的形态发生是必不可少的。
另一方面，转录学的应用将揭示器官中产生的细胞类型的复杂性，特定细胞群体相对于其他细胞群体的比例，以及它们的分化状态和空间分布。所有这些信息最终将有助于提高当前hPSC-器官分化过程的有效性、重复性和稳健性。
此外，确定适当的放大原则以保持生理参数的绝对值和器官内不同类型细胞之间适当的相对比例，可能有助于更好地模拟体内的生理条件。在稳态和类疾病条件下询问类器官生物功能时，加强对多种组织-组织相互作用的控制，最终将支持hPSC-器官技术在个性化和精确化医学中的新时代应用。