美国加州大学Martin Kampmann和Lea T. Grinberg团队合作揭示了阿尔茨海默氏病（AD）中选择性脆弱神经元的分子特征。该项研究成果发表在2021年初1月11日出版的《Nature Neuroscience》杂志上。
在哺乳动物中，内嗅皮层（EC）是一种在系统发育上相对保守的大脑结构，它是最先积累tau阳性神经原纤维包涵体并产生神经元丢失的皮层区域之一。RORB(RAR-RelatedOrphan Receptor B)编码一种转录因子，被认为是新皮质层神经元的标志蛋白和发育驱动因子。
研究者选取10名携带ApoEε3/ε3基因男性患者死后脑组织细胞核进行单核RNA测序（snRNA-seq）分析，结合用于可测量的神经原纤维包涵体聚集与临床认知功能下降的相关性的Braak评分系统，推测疾病不同阶段与EC和上额回（SFG）组织匹配的Braak评分，从而评估疾病进程对细胞类型及其亚群的影响。
1、阿尔茨海默病程中伴随多种细胞亚型改变
研究者从EC、SFG中分别收集42,528、63,608个细胞，检测其平均基因数和唯一分子标志(UMI)发现，与之前发布的AD snRNA-seq数据集相比，转录本覆盖率相似或更高。通过交叉样本比对后，研究者进行了聚类和恢复聚类分析，表明t 分布随机邻域嵌入（t-SNE）中的空间分组与个体起源基本无关(图1b，c)。
此外，群集显示不同细胞类型标记的特异性表达，并以与分级聚类中的细胞标记的表达方式一致(图1d，e)。消除技术和实验因素对聚类的影响后，根据细胞表达的标记分子将集群分为多种细胞类型，包括兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、小胶质细胞和内皮细胞。
研究者为每个参与者聚类分配到相同细胞类型的簇，然后计算每个个体中细胞类型的相对丰度。使用beta回归检验以及Holm法进行多重检验校正。虽然细胞类型的相对丰度在统计学上没有太大的变化，但观察到在Braak阶段2(Punadting=0.18)和6(Punadting=0.02)的EC兴奋神经元的相对丰度有下降的趋势，而SFG兴奋神经元的相对丰度仅在Braak阶段6(Punadting=0.05)下降，表明兴奋神经元相对于AD的抑制性神经元更脆弱。
2、兴奋性神经元亚群的选择性脆性
通过交叉样本对比EC和SFG中的兴奋性神经元进行亚群聚类分析，探讨特定的兴奋性神经元亚群是否随着疾病的进展而相对丰度显著下降。为鉴定EC(EC：Exc.s2，EC：Exc.s4和EC：Exc.s1)中选择性脆弱的兴奋性神经元亚群的分子标记，检测不同亚群间差异表达的基因的转录水平，最终，发现一组不超过四个亚群特异性表达RORB的EC:Exc.s2和EC:Exc.s4，CTC-340A15.2和CTC-535M15.2(图2c)。
研究者重点分析EC：Exc.s2和EC：Exc.s4，其表达较高的基因富含轴突定位蛋白和电压门控钾通道，而表达较低的基因富含突触和树突定位蛋白以及涉及G蛋白介导的信号传导、离子转运和神经递质受体信号传导的通路。
分析SFG的兴奋性神经元亚群后，发现共有11个表达不同的新皮质层特异性基因群(图2b，d)，从而重现新皮层的层状结构。有趣的是，研究者在EC中发现SFG：Exc.s4和SFG：Exc.s2的脆弱性标记(RORB，CTC-340A15.2和CTC-535M15.2)标记，只在Braak第6阶段(图2D)才表现相对丰度下降趋势，与SFG中晚期出现的神经原纤维包涵体的起始于Braak第5阶段一致。
3、验证表达RORB的兴奋性神经元选择性脆弱性
为验证AD患者EC表达RORB的兴奋性神经元脆弱性，研究者对26名死于Braak 0至6期的患者进行了多重免疫荧光法标记核（DAPI），兴奋性神经元（TBR1），RORB+神经元和磷酸化tau神经元内含物（CP13，可检测到在202位磷酸化的tau蛋白）。对比与Braak阶段0-1，研究者观察到Braak阶段2-4和5-6的兴奋性神经元中RORB +神经元的比例降低（图3d，e）。
此外，与RORB-兴奋性神经元相比，通过分析AD患者的子集，研究者在RORB +中优先检测到了磷酸化tau（CP13）（图3f，g）。从而证实了表达RORB的兴奋性神经元在AD中非常脆弱，并支持其耗竭是tau神经原纤维堆积的结果。
4、总结
作者通过配对AD患者和正常对照者的大脑区域snRNA-seq分析，对AD患者选择性脆弱的神经元群体进行了开创性的分子表征，为将来的动物和体外模型中选择性易损性机制的基础研究提供参考，如人类诱导多能干细胞衍生的神经元，其中CRISPR抑制和激活技术的应用能够阐明转录组变化的功能。该文不足是仅仅分析中只包括携带APOEε3/ε3基因型的男性患者，将来的研究应针对性别和APOE地位对阿尔茨海默病选择性易感性的影响进行系统分析。
参考文献：
Leng K, Li E, Eser R,Piergies A, Sit R, Tan M, Neff N, Li SH, Rodriguez RD, Suemoto CK, Leite REP,Ehrenberg AJ, Pasqualucci CA, Seeley WW, Spina S, Heinsen H, Grinberg LT, Kampmann M (2021). Molecular characterizationof selectively vulnerable neurons in Alzheimer's disease. Nature neuroscience.
编译作者：栗子雨 (Brainnews创作团队)
校审：胖兔子可可 (Brainnews编辑部)