撰文 | 十一月
责编 | Qi
根据细胞死亡的最终形态，可以将细胞死亡分为溶解性（Lytic）和非溶解性（Non-lytic）两种类型【1】。死亡之舞（Dance of Death）是细胞凋亡（Apoptosis）的典型特征，而细胞肿胀质膜破裂则是各种坏死（Necrosis）比如坏死性凋亡（Necroptosis）、细胞焦亡（Pyroptosis）、铁死亡（Ferroptosis）以及偶发性细胞死亡（Accidental cell death）等的特征【1】。质膜破裂（Plasma membrane rupture，PMR）是溶解性细胞死亡的最终崩坏的事件。PMR会释放细胞内的分子，该过程被称为损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMP），该过程会传递炎症反应【2, 3】。但是一直以来，PMR过程的具体分子机制还不得而知。
2021年1月20日，美国Genentech公司Vishva M. Dixit研究组以及Nobuhiko Kayagaki（第一作者）在Nature杂志上合作发表了一篇题为NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death的文章，该研究通过遗传筛选鉴定出了NINJ1因子在PMR中的重要调控作用，推翻了一直以来认为细胞死亡相关的质膜破裂是一个被动事件的教条认知。
细胞焦亡是一种由多种感染性和无菌损伤引发的溶解性细胞死亡的强效炎症模式【4】。该过程主要由孔形成片段GSDMD（gasdermin D）驱动【5-8】，与此同时细胞释放出两种蛋白：预炎症细胞因子IL-1β以及PMR以及溶解性细胞死亡标记物LDH。早期里程碑式的研究曾经预测细胞焦亡中的两个关键步骤：1）质膜上形成小孔造成IL-1β的释放并出现无选择性的离子外流；2）随后细胞进一步肿胀造成PMR【9】。PMR释放LDH以及较大的DAMPs。gasdermin孔径的预测大小约为18nm，足够4.5nm左右的IL-1β释放出来，鉴于此，随后PMR过程的具体发生机制也被认为是一个被动渗透溶解过程。
为了鉴定PMR的关键调节因子，作者们建立了一个骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDMs）的正向遗传筛选方案。通过该筛选以及外显子测序，作者们鉴定发现了19个单核苷酸变体。通过进一步地表型分析和基因型鉴定，作者们发现了编码NINJ1的基因（图1）。NINJ1是一个大小为16kDa的细胞表面蛋白，具有两个跨膜结构域，呈现Nout/Cout的拓扑结构（图1）。先前为数不多的研究发现NINJ1是一个广泛表达在骨髓细胞和中枢神经系统的与炎症和肿瘤抑制相关的黏附分子【10】。
图1. 正向遗传学鉴定发现与PMR相关的因子NINJ1
在BMDMs细胞中敲除Ninj-/-以及Gsdmd-/-与单独敲除Ninj-/-类似，会造成LDH对于脂多糖、尼日利亚菌素等响应变弱，释放更少的LDH。但是NINJ的敲除并不会影响GSDMD依赖的、尺寸较小的染料的释放以及摄取。因此，在Ninj-/-的BMDMs细胞中会出现存在GSDMD孔形成的细胞。因此，NINJ1对于PMR非常关键，但是对于GSDMD的形成是可有可无的。
进一步地，由于PMR的孔径更大，作者们认为NINJ1介导的PMR会释放比LDH更多的蛋白。为了证实这一假说，通过分泌物组分析，作者们一共检测到780种分子，其中包括较大的预炎症HMGB1（High Mobility Group Box 1）复合物（HMGB1本身并不大，但是会与核小体以及多种转录因子形成复合物难以通过GSMDM驱动形成的18nm孔径），这些分子对于胞质脂多糖的响应的释放均依赖于NINJ1，说明NINJ1重要的预防炎症功能。
那么，NINJ1在PMR过程中是如何发挥作用的呢？作者们将人源或者鼠源的NINJ1表达在HEK293T细胞中，会造成显著的细胞毒性并伴随LDH的释放。果蝇同源的dNINJ-A以及dNINJ-B的表达也具有细胞毒性。因此，NINJ1的功能在进化上是非常保守的。通过对NINJ1的蛋白质结构域进行分析，作者们发现NINJ1中包含一个α-螺旋结构域并且发现该结构域对于NINJ1的功能非常关键。进一步地，作者们使用非变性blue native-PAGE实验检测发现在保留天然蛋白结构的情况下，NINJ1在未刺激的BMDMs细胞中会存在二聚化或者是三聚化的形式，而在响应细胞死亡刺激的情况下会进一步的多聚化。免疫染色的结果也正是在经历尼日利亚菌素刺激后，细胞中的NINJ1中会产生多个斑点类似的聚集体，证明了NINJ1在PMR过程中的多聚化。
图2. NINJ1关键蛋白结构域以及功能突变分析
总的来说，作者们的工作发现进化上保守的细胞表面蛋白NINJ1调节PMR过程以及DAMPs释放的具体分子机制，在炎症反应的传递过程中发挥着关键性作用。由于NINJ1在PMR诱导过程中的潜在以及广泛的作用，与包括细胞焦亡、凋亡、坏死等方面DAMPs释放相关，可能会作为重要的治疗的靶向位点。在内源表达NINJ1的细胞中加入NINJ1的单克隆抗体，可以相当于遗传敲除的方式抑制PMR过程，进一步阐释了NINJ1在医药研发以及治疗方面的重要作用。
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03218-7
制版人：Kira
参考文献
1. Vicar, T., Raudenska, M., Gumulec, J. & Balvan, J. The Quantitative-Phase Dynamics of Apoptosis and Lytic Cell Death.Scientific Reports10, 1566, doi:10.1038/s41598-020-58474-w (2020).
2. Gaidt, M. M. & Hornung, V. Pore formation by GSDMD is the effector mechanism of pyroptosis.The EMBO journal35, 2167-2169, doi:10.15252/embj.201695415 (2016).
3. Kayagaki, N. & Dixit, V. M. Rescue from a fiery death: A therapeutic endeavor.Science(New York, N.Y.) 366, 688-689, doi:10.1126/science.aaw1177 (2019).
4. Cookson, B. T. & Brennan, M. A. Pro-inflammatory programmed cell death.Trends in microbiology9, 113-114, doi:10.1016/s0966-842x(00)01936-3 (2001).
5. Liu, X. et al. Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores.Nature535, 153-158, doi:10.1038/nature18629 (2016).
6. Ding, J. et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family.Nature535, 111-116, doi:10.1038/nature18590 (2016).
7. Kayagaki, N. et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.Nature526, 666-671, doi:10.1038/nature15541 (2015).
8. Shi, J. et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.Nature526, 660-665, doi:10.1038/nature15514 (2015).
9. Fink, S. L. & Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.Cellular microbiology8, 1812-1825, doi:10.1111/j.1462-5822.2006.00751.x (2006).
10. Araki, T. & Milbrandt, J. Ninjurin, a novel adhesion molecule, is induced by nerve injury and promotes axonal growth.Neuron17, 353-361, doi:10.1016/s0896-6273(00)80166-x (1996).