在过去的十年里，生物工程人造血管一直是热门领域。尤其是小直径血管，因目前手术选择有限，本研究旨在利用三维微挤压生物打印机在固体平台上，用明胶甲基丙烯酰基(GelMA)生物墨水一步制备出小直径、非均质双层血管样结构。
将透明质酸(HA)、甘油和明胶添加到GelMA生物墨水中，形成了具有良好印刷性能、机械强度和生物相容性的GelMA生物墨水。选择孔径不同的两种不同浓度的GelMA生物墨水制备非均相双层膜。用较高浓度的GelMA生物墨水(6%w/v GelMA,2%明胶,0·3%w/v HA,10%v/v甘油)负载人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，形成内皮细胞层。
使用较低浓度的GelMA生物墨水(4%w/v GelMA,4%明胶,0·3%w/v HA,10%v/v甘油)负载平滑肌细胞(SMC)并形成外层肌肉组织层。然后用Instron力学测试和缝合能力评估生物打印的血管样移植物的机械性能，以及包括存活率、增殖和组织学分析在内的生物学特性。由此产生的20mm长、4.0mm直径的管腔异质双层血管样构造非常接近于天然血管，并保持了较高的细胞活性和增殖能力。
心血管疾病是全球主要的死亡原因。对于这些患者中的许多人来说，需要血管移植物来搭桥或替换闭塞或受损的血管。目前，黄金标准的护理使用自体动脉或静脉作为血管移植的管道。虽然自体血管有很多优点，但由于先前的移植手术、受损的血管或外周血管疾病，三分之一的患者不适合自体血管。因此，对工程化人造血管有巨大的需求。不幸的是，用合成生物材料替换受损血管往往会导致失败，特别是在替换小直径血管（<6 mm)时。小直径血管的低血流量和高表面积与血容量比导致高闭塞频率、血栓形成和狭窄。
血管组织工程的最新进展探索了具有可调生物材料的血管移植物的发展，这种材料模仿了基本的天然血管结构。虽然这种方法在临床前研究中取得了成功，但也发现了一些缺点，包括多种细胞类型的空间分布不完整，支架微结构控制不佳，以及细胞在支架中种植的不均匀。
为了应对这些挑战，三维(3D)生物打印被确定为一种新的组织工程技术，它可以改善对细胞空间分布和支架微结构的控制。生物打印技术允许精确和可重复地制造嵌入水凝胶中或没有支撑支架的细胞结构。
在这项研究中，Lei Xu团队提出了一种新的方法，利用三维生物打印技术一步到位地构建双层血管样构造物。这是利用可调的明胶甲基丙烯酰基(GelMA)孔隙率通过改变GelMA生物墨水浓度来实现的。用这些水凝胶与人脐静脉内皮细胞(HUVECs）和平滑肌细胞（SMCs）构建异质双层管状结构，分别形成仿生的内膜和中膜。系统地研究了生物印迹管状结构内、外层的生物力学特性。团队还研究了不同结构成熟阶段内皮细胞和平滑肌细胞在管腔和外表面的黏附和增殖情况。这项工作代表着在生物工程血管中使用可调节的GelMA特性来增强细胞附着、增殖和功能方面向前迈出了新的一步。
明胶甲基丙烯酰基(GelMA)的合成如前所述（图1(A)）。简单地说，将8.0g明胶溶解在50ml0.25M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9，室温）中，在55◦C下反应1h，然后滴加0.5ml甲基丙烯酸酐，然后在55◦C下搅拌3h。加入80ml杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水停止反应，用12~14 kDa截断透析管，在37◦C下对蒸馏水透析1周，除去盐和甲基丙烯酸。混合物通过真空过滤器过滤，在−20◦C下冷却数小时，在−80◦C下冷冻过夜，然后冷冻干燥1周，产生白色多孔泡沫，并在−80◦C下储存直至使用。
图1.甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)的合成与鉴定。(A1)明胶与甲基丙烯酸酐反应生成甲基丙烯酸酯基。(A2)在光引发剂存在下，用紫外光照射使甲基丙烯酸酯明胶交联，形成水凝胶网络。(B)明胶和GelMA确认的明胶甲基化的1H-NMR谱
图1(A1)显示了明胶和甲基丙烯酸酐形成凝胶的反应，如前所述。GelMA在紫外线刺激下与Irgacure 2959反应形成凝胶(图1(A2))。用1HNMR确证了我们合成的GelMA的结构。GelMA光谱有对应于甲基丙烯酸酯双键的两个自由质子的峰，化学位移在5.5和6.0ppm之间，而对照明胶的光谱中缺少这一点（图1(B)）。GelMA的物理机械性能与每个样品中的甲基化程度有关。因此，甲基丙烯酸化程度越高，水凝胶就越持久和坚硬。
图2.不同重量/体积浓度的GelMA生物墨水的孔径分析。(A)八种浓度的GelMA生物墨水的扫描电镜照片。(2)8种浓度凝胶生物墨水的孔径测定(∗∗，P<0·01；∗∗∗，P<0·001；NS，无显著性)。(C1)和(C2)GelMA生物墨水和GelMA的扫描电镜照片。(D)GelMA生物墨水和GelMA的孔径评估(NS，不显著)。比例尺：200µm。
细胞类型大小不一，因此支架的孔径大小对细胞的增殖、迁移和分化至关重要。为了评估GelMA浓度对构建物孔径的影响，制备了含有8种不同重量/体积浓度(3、4、5、6、7、8、10和15%）的GelMA生物墨水构建物，并对其进行了分析。观察到构建物的孔径随着生物墨水中GelMA浓度的增加而减小（图2(A)）。得到的平均孔径为248.9±80.3um(3%GelMA)、148.3±44.1um(4%GelMA-93.5um(5%GelMA)-67.3um(6%GelMA)-64.7um(7%GelMA)、47.9um(8%GelMA)、22.2µm(10%GelMA)和2.2µm(15%GelMA)(图2(B))。生物墨水中明胶、甘油和HA的加入不影响构建物的孔径。相同浓度的GelMA生物墨水和纯GelMA的扫描电子显微镜如图2(C1)和(C2)所示，用Image J分析的孔径没有差异（图2(D)）。
图3.GelMA生物油墨的印刷气压评估。(A)8种浓度的GelMA生物墨水的气压。(B)气动压力随明胶含量的降低而变化。(C)160kPa和100kPa下人脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞的活/死检测。(D)160kPa和100kPa下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和平滑肌细胞(SMC)的活性测定。(∗，P<0·0 5；∗∗，P<0·0 1；∗∗∗，P<0·001；NS，P<0·0 1)。
团队对8种不同重量/体积浓度(3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%和15%）的GelMA生物墨水进行了评估，以确定生物打印过程的最佳注射器分配压力。观察到分配所需的气压（以kPa为单位）随着所测试的GelMA重量/体积浓度的增加而成比例地增加（图3(A)）。在100kPa的气压下，4%的凝胶生物墨水和40 mg ml的明胶可以很好地分散，细胞的存活率很高(90·1±4·7%）。而对于6%GelMA生物墨水和40 mg ml−1的人脐静脉内皮细胞，则需要160kPa左右的高压，细胞存活率(34·7±7·7%)明显降低。将生物墨水中的明胶浓度从40mgml−1降低到20mgml−1有助于将分配所需的气压降低到100kPa左右（图3(B)），从而使人脐静脉内皮细胞具有良好的细胞存活率(86·8±5·7%）（图3(C)和(D)）。
图4.两种浓度GelMA生物油墨的参数化。(A)GelMA和GelMA生物油墨的粘度。(B)4%和6%GelMA生物墨水的流变学评价。储能模量(G‘）大于损耗模量(G“）。(3)4%和6%凝胶生物墨水的溶胀度(∗，P<0·0 5)。(D1-D2)使用WFIRM打印编码程序对设计为两层的血管样构造进行3D渲染。绿色代表6%的GelMA生物墨水负载HUVEC；红色代表4%的GelMA生物墨水负载SMC。(E)管子的俯视图和(F)管子的侧视图
粘度是评价生物油墨打印性能的重要指标。在GelMA生物墨水中加入HA和甘油，以增加其粘度，防止喷嘴堵塞。图4(A)显示GelMA生物油墨的粘度大于纯GelMA。对由4%GelMA、6%GelMA以及4%和6%GelMA组合制成的印刷构件进行了物理表征。储存模量(G‘）测量印刷构件的储存能量，指其弹性，而损耗模量(G“）测量印刷构件释放的能量，指其黏性成分。图4(B)显示了上述三种印刷结构在交联后的储存模量高于损耗模量。
图5.印刷血管样结构的机械性能和缝合能力。(A)应力-应变曲线。(2)三维生物打印构件的Y oung‘s模量(∗∗，P<0·0 1)。(C)三维生物打印血管样结构的拉伸应力。(D)-(F)管状结构的缝合能力。比例尺为4毫米。
使用Instron机械测试仪对3D生物打印的管状结构在成熟期第1天的抗张强度进行测试。由4%的GelMA生物墨水、6%的GelMA生物墨水以及4%和6%的GelMA生物墨水组合制成的结构的应力-应变曲线相似（图5(A)）。由4%和6%的凝胶生物墨水制成的双层结构的弹性模量和拉应力明显大于由4%的凝胶生物墨水制成的对照结构（∗∗，P<0·0 1)，但明显小于由6%的凝胶生物墨水制成的双层结构（∗，P<0·0 5)（图5(B)-(C)）。管状结构的缝合能力也通过将两块切割的管状结构缝合在一起来证实（图5(D)-(F)）。
图6.生物印染的小管结构中的细胞活性和增殖。(A)-(C)三维生物打印血管样结构横截面的扫描电镜照片。(D)3D生物打印管状结构的细胞活性评估（第1天、第4天、第7天）。(E)第1、4、7天的细胞活力。(F)第1、4、7天用MTT法检测细胞增殖。
扫描电子显微镜显示，双层结构的内层的孔径较小，而外层的孔径较大（图6(A)-(C)）。活/死试验用于评估生物印染的血管样结构中的细胞活性。活/死染色后用共聚焦显微镜观察活/死结果。(A)-(F)显示了第一天、第四天和第七天的荧光图像，放大倍数分别为5倍和10倍。细胞在打印后第1天保持其打印位置。培养4d后，细胞开始伸展并相互连接。培养7d后，细胞伸长率明显高于培养4d。培养1d、4d和7d的细胞存活率分别为(93·6±1·4)%、(87·2±2·6)%和(89·8±1·9)%。这些结果表明，打印后的打印管状结构可以获得高细胞存活率（图6(E)）。
图7.细胞3D生物打印结构的分析。(A)在第七天追踪预先标记的HUVECs和SMCs在三维生物管桩结构上的情况。(B)培养7d后(12·5×，50×，100×)三维生物打印小管构建物苏木精-伊红染色。(C)在培养的第7天(50×）对3D生物打印的管状结构进行免疫荧光染色。比例尺：200µm。
分别用绿色和红色荧光染料预标记人脐静脉内皮细胞(HUVECs）和平滑肌细胞（SMC)，以确定HUVECs和SMC在三维生物印迹的管状结构中是否有交叉层。对具有预先标记细胞的管状结构的共聚焦评估显示，随着时间的推移，HUVECs和SMC保持分离，随着时间的推移形成不同的内、外层（图7(A)）。
肾小管结构苏木精和伊红染色显示，在成熟后7天，人脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞分别形成不同的内、外细胞层（图7(B)）。CD31和α-SMA对这些结构的免疫荧光评估进一步证实了明显的内皮层和外平滑肌层（图7(C)）。
本研究表明，利用三维生物打印技术在无支架的情况下一步构建长垂直双层非均质小口径血管样结构是可行的。6%和4%(w/v)的凝胶生物墨水产生独特的不同孔径(分别为67·315·7µm和148·3±44·1µm)，分别是生物打印HUVEC和SMC的最佳选择。
本研究使用的细胞载GelMA生物墨水在生物打印和成熟培养一周后，为细胞特异性生物标志物的增殖和表达提供了适宜的微环境。这些结果为未来3D血管生物打印的研究奠定了坚实的基础，在3D血管生物打印中，细胞紧密连接、细胞生长和机械性能都可以得到优化。
未来的其他方向包括使用生物反应器在生理条件下进行体外血管调节，以及在动物模型中植入生物打印的血管以确定安全性和有效性，最终，这项工作可以满足人类患者对小直径血管治疗心血管疾病的巨大需求。