生物工程纤维软骨组织以恢复半月板功能的先进策略是医学的迫切需要。目前，生物3D打印技术已被用于制造与临床相关的患者特定的复杂结构，以满足临床需求。
在本研究中，通过将载细胞结冷胶/纤维蛋白原(GG/FB)复合生物墨水和丝素蛋白甲基丙烯酸化（SiL-MA)生物墨水以交错图案的方式共同打印，制备了一种用于纤维软骨再生的高弹性复合结构。
研究团队通过测量生物墨水的流变性能、溶胀度和压缩力学行为来表征每种生物墨水配方。为了进行体外生物学评价，分离猪原代半月板细胞（pMCs），并将其悬浮在GG/FB生物墨水中进行打印。
结果表明，GG/FB生物墨水提供了良好的细胞微环境，可维持细胞的活力和增殖能力以及生物打印构建物种pMCs的成熟，而SiL-MA生物墨水具有良好的生物力学行为和结构完整性。
更重要的是，这个生物打印的杂交系统显示了在移植后10周的小鼠皮下植入模型中纤维软骨组织的形成，而没有尺寸变化。特别是，胶原纤维的排列是在生物印染的杂化结构中实现的。结果表明，这种生物打印的机械增强的复合结构为生产先进的纤维软骨组织提供了一种通用并且有前途的替代方案。
纤维软骨主要见于膝关节的半月板、颞下颌关节和椎间盘纤维环。半月板是无血管的，导致内在再生能力差，损伤往往导致退行性疾病。由于半月板组织退行性变的患者数量增加，关节镜下半月板部分切除术是最常见的骨科手术之一。因此，迫切需要先进的生物工程策略来构建纤维软骨组织。
生物3D打印技术为患者特定结构的生物制造提供了有前途的和通用的选择。这是通过在单个组织结构中精确地沉积多种成分，包括细胞和生物材料（也称为生物墨水）来实现的。生物墨水提供了一个3D网络，能够模拟体内的微环境，以支持细胞的粘附、增殖和分化。此外，打印结构的功能和生物力学特性可以通过生物墨水组合物进行调节。因此，生物打印的组织结构应该提供组织特异性的生物力学和生物微环境，以确保打印后的细胞表型和成熟。在可打印性、细胞封装能力和活性、结构物理性能（即降解、结构保持等）的控制以及组织特定功能的机械行为之间不断进行折衷，以实现预期的结果。
一些天然和合成的生物材料，如纤维蛋白原(FB)、明胶、海藻酸盐、透明质酸(HA)、胶原蛋白、聚己内酯PCL)、和聚乙二醇（PEG)已被广泛用于3D组织结构的生物制造中，在某些情况下，它们一起用于改善生物墨水的特性。此外，已经提出了混合系统以实现生物和机械性能。例如，天然衍生的水凝胶用作细胞载体材料，而合成的热塑性聚合物用作支持结构材料。然而，基于水凝胶的生物墨水受到结构完整性差、机械稳定性差、可打印性差以及快速降解速率的限制。同样，合成聚合物不能提供适当的生物微环境。这可能导致细胞粘附力降低，从而导致植入物生物相容性较弱。此外，这些合成聚合物表现出缓慢的降解和不适当的机械硬度。目前正在引入更先进的生物墨水系统来克服这些当前的挑战；然而，尽管生物打印技术有了显著的改进，挑战仍然存在。
对于纤维软骨组织的再生，生物墨水应该提供合适的细胞微环境和生物力学稳定性，以支持印刷细胞对组织特异性细胞外基质成分的稳定沉积。尤其是，生物墨水应该能够承受半月板修复过程中的循环压缩负荷。
为了满足所有这些要求，João B. Costa团队开发了一种新型的3D复合组织结构。通过依次将含有猪半月板细胞（pMCs）的细胞结冷胶(GG)和含有猪半月板细胞（PMC)的FB复合生物墨水（图1A)和丝素蛋白甲基丙烯酸酯（SiL-MA)生物墨水（图1B)共打印，以用于纤维软骨组织的再生。
图1.生物打印复合组织结构的生物墨水配方示意图。(A)GG和FB复合生物墨水，通过离子和酶交联形成稳定的水凝胶。(B)通过与MA反应，用甲基丙烯酸酯基团对SF进行化学改性，生成SiL-MA。
研究团队假设，载细胞的GG/FB生物墨水将提供细胞活动和组织形成所需的生物微环境，而SiL-MA生物墨水将提供3D打印过程所需的机械支持和稳定性，以及打印组织构建物的结构完整性和力学性能。通过测量细胞活性、增殖和体外成熟来检测生物打印的杂交组织结构，并使用小鼠皮下植入模型验证纤维软骨组织的形成、组织和尺寸维持。
GG/FB复合生物墨水的制备与表征。对6种不同浓度的FB(1、2、3、4、5和6 mg/mL)与GG混合进行了流变学评价(表1)，并以GG作为单独对照。在不同频率和低应变下的振荡测量表明，所有GG/FB生物墨水配方之间没有显著差异（图S1)。GG/FB复合生物墨水主要表现为弹性行为(G‘>G“）。。此外，所有生物油墨配方都表现出剪切变稀行为，这在基于挤压的生物打印中是至关重要的（图2A)。
图2.GG/FB生物墨水的材料特性和体外生物学评价。(A)不同FB浓度的GG/FB生物油墨交联前的粘度和(B)交联后GG/FB水凝胶的压缩弹性模量。(C)仅在GG和GG/FB4载体中打印的pMCs在培养1、3、7和14天显示活力的活/死染色图像，活细胞以绿色染色，死亡细胞以红色染色（比例尺：200μm)。(D)经AlamarBlue实验证实，印刷的PMC在GG和GG/FB4载体中的代谢活性在,培养的第1、3、7和14天的GG和GG/FB4结构中打印pMCs的代谢活性。在培养14天和28天时，定量测定GG单独和GG/FB4构建中(E)胶原和(F)GAG的产生。(G)培养28天后生物打印的GG和GG/FB4结构的非极化（左）和极化（右）印迹印记的GG和GG/FB4结构的印迹红染色图像（比例尺：50μm)。*p<0.5，**p<0.0 1，*p<0.001，差异有统计学意义。对照组为单纯GG组，不加FB组。
为了评估生物墨水的生物学性能，包裹细胞的细胞外基质沉积也是一个需要解决的重要特征。纤维软骨是一种高度包埋在细胞外基质(ECM·39，40)内的无血管和神经组织，因此，ECM沉积的存在是被包裹的pMCs细胞功能的一个指标。当包裹在GG/FB4生物墨水中时，与单独使用GG生物墨水相比，pMCs在体外培养28d后显示出更多的胶原(*p<0·001·0 5，图2E)和GAG(*p<0·0 5，图2F)。有趣的是，在GG/FB4生物墨水结构的表面区域发现了软骨膜样胶原沉积，而GAG的产生发生在整个结构区域（图2G和图S2)。
纤维软骨组织的特征是存在于承受较大压缩和拉伸载荷的人体区域。尽管GG/FB4结构具有更好的力学性能和结构完整性，但其力学性能和稳定性不能满足纤维软骨再生的要求。在此，我们开发了SiL-MA生物墨水，为生物工程纤维软骨组织构建提供更好的力学性能和结构完整性。制备了三种不同甲基丙烯酸化程度的SiL-MA基生物油墨。根据甲基丙烯酸缩水甘油酯用量的不同，得到了63.5%[SiL-MA(H)]、57.2%[SiL-MA(M)]和44.5%[SiL-MA(L)]的甲基丙烯酸缩水甘油酯用于进一步的实验(图S3)。
对于印刷过程，明胶引入了热敏性能，而甘油则提高了分配均匀性，防止了喷嘴堵塞.8流变测试表明，SF的化学修饰没有影响生物油墨的流变行为，这些SiL-MA生物油墨表现出所需的弹性(G‘>G“）和剪切稀化行为（图3A和图S4A，B)。
图3.SiL-MA生物墨水的材料表征和体外生物学评价。(A)不同甲基丙烯酸酯度的SiL-MA生物油墨的粘度。(B)在孵化第0、1、7、14天时发生构象变化。(C)在培养的0、1、7、14天，SiL-MA支架的压缩弹性模量(*与SiL-MA(L)在0、7、14天相比P<0.05；*与SiL-MA(M)在1天时的压缩弹性模量比较，以及**与其他三种材料的比较**p<0.05)。(D)不同甲基丙烯酸酯度的SiL-MA结构的扫描电镜图像。(E)接种SiL-MA构建物的pMCs在培养第1、3和7天的活/死染色图像，活细胞以绿色染色，死细胞以红色（比例尺：200μm)染色。(F)AlamarBlue实验证实，接种于SiL-MA载体中的pMCs在培养的第1、3和7天具有代谢活性(N·S·：不显著）
结果表明，尽管印刷过程中使用了不同程度的甲基丙烯酸甲酯，但流变行为高度依赖于明胶和甘油，因为明胶和甘油提供了适当的可打印性。最终，这些基于SiL-MA的生物墨水配方可以打印3D组织结构，具有良好的打印保真度和易操作性。
研究团队还在水溶液条件下测定了SiL-MA构象随时间的变化。这些构象可以通过从无规卷曲到晶体构象（β-Sheet）的自发构象变化来检测。在本研究中，通过紫外光曝光的光交联过程也证实了SiL-MA构象的自发构象变化。通过改变甲基丙烯酸酯的程度，结果表明有可能调节构象变化的速率，以及随着时间的推移机械性能的改善（图3B，C和图S4C)。
研究团队测定了不同交联度的Sil-MA结构的孔径和溶胀率。扫描电镜观察显示，与Sil-MA(M)和Sil-MA(L)构建物相比，SIL-MA(H)构建物具有更小的孔隙(图3D)。此外，甲基丙烯酸酯度较高的SIL-MA结构的溶胀率较低（图S4D)。为了评价Sil-MA生物墨水的体外生物学特性，将pMCs种植到Sil-MA构建物上。活性（图3E)和代谢活性（图3F)分析表明，所有Sil-MA生物墨水都支持细胞粘附，并在培养7天内保持代谢活性。在比较三种不同的Sil-MA结构时，没有发现明显的差异。
丝素增强复合组织构建生物3D打印的体外评价。在上述实验的基础上，选择GG/FB4和Sil-MA(H)进行三维杂化纤维软骨组织构建物的生物打印。与其他配方相比，GG/FB4生物墨水配方在保持生物特性的同时具有最高的压缩弹性模量。
图4.生物3D打印混合结构的压缩力学性能。(A)生物印迹的SiL-MA(H)、GG/FB4和混杂结构在孵育0天和14天的应变-−应变曲线和压缩弹性模量(*P<0·0 5与GG/FB4相比，**N·S·：无显著性)。(C)3D生物打印的SiL-MA(H)和混合结构在压缩测试下的外观。生物印迹(D)、SiL-MA(H)和(E)杂化结构的压缩循环应力−弛豫曲线。
图5.3D生物打印杂交构建物的体内生物学特性。(A)用于生产3D生物打印构件的打印图案方案以及植入后2、5和10周外植体的大体外观。(B)植入后2、5和10周的三维生物打印结构的尺寸变化和(C)压缩弹性模量（*p<0·05，**N·S·：无显著性）
三维生物打印杂化构建物的体内纤维软骨再生。为了验证生物打印迹杂化构建物用于纤维软骨再生的可行性，将构建物植入裸鼠皮下，分别于植入后2、5、10周取材。宏观评估显示，在植入10周期间，杂化结构保持了其原始尺寸，并且在SiL-MA(H)和杂化结构中观察到了血管化（图5A，B)。
组织学分析显示，在GG/FB4和混合结构中形成了纤维软骨样组织（图6A，B)。两组GAG和胶原基质的产生分别用藏Safranin O染色和Masson‘s三色染色证实。定量显示GAG和胶原基质的产生随着时间的延长而增加（图6C，D)。结果表明，植入后10周，复合支架的GAG含量(0·4±0·0 1μg/mg)和胶原含量(4·71±0·15μg/mg)均明显高于其他支架。正如预期的那样，无细胞的GG/FB4结构产生的细胞外基质较少，组织学分析仅显示宿主组织浸润(图S5）。
图6.生物3D打印杂化构建物的组织学和生化检查。植入2、5和10周后(A)GG/FB4和(B)杂交构建物的3D生物打印的组织学图像(比例尺：200μm)。在植入后2、5和10周，定量测定生物阴迹构建物(C)GAG和(D)胶原的产生；SiL-MA(H)、GG/FB4、杂交体和无细胞的GG/F4(*p<0.05与GG/FB4(-细胞)相比，**p<0.05与SiL-MA(H)相比，以及*p<0.05与其他组相比)
为了检查胶原组织的成熟，研究团队用阿Alcian Blue/Sirius Red进行了成像分析。染色后的标本在偏振光下观察，分析胶原基质（图7A，B)。
图7.植入2、5和10周后，3D生物打印结构中偏振的PicroSirius Red染色的胶原纤维的定量。生物打印的(A)GG/FB4和(B)杂交结构(比例尺：100μm)的未偏振和偏振的Alcian Blue/Sirius Red染色图像。使用定制的MATLAB代码计算(C)GG/FB4和(D)混合结构中每种胶原纤维颜色的平均百分比。(E)典型偏振图像(比例尺：20μm)和(F)植入后10周和天然(猪半月板)生物打印结构的比对分析(*与GG/FB4，N·S·相比，P<0·05，无显著性)。
以FB/GG为载体的生物墨水和丝素为基础的生物墨水生物打印构建了纤维软骨组织再生的组织结构。这些新型生物墨水配方提供了对细胞友好的生物微环境以及结构完整性。
体内研究表明，生物打印的杂化组织构建物能够在植入后10周内保持其结构尺寸和足够的生物力学性能，更重要的是，能够使组织成熟和细胞外基质沉积类似于天然半月板组织。这些新型生物墨水的通用性和可调性表明，该系统可能用于需要机械增强组织结构的不同组织工程应用。