这项研究的目标是使用3D生物打印技术创建包含人牙髓干细胞(HDPSCs)的生物工程牙科结构。为了实现这一目标，研究团队首先开发了一种新型的骨形态发生蛋白(BMP)肽-栓系生物墨水配方，并检测了其流变特性、可印刷性和生物打印构建体的结构稳定性。
其次，通过测量细胞活力、增殖和基因表达，以及组织学和免疫荧光分析，评估了hDPSCs在生物打印牙科结构中的存活和分化。结果表明，多肽成功地偶联到基于甲基丙烯酸明胶(GelMA)的生物墨水配方中。
团队发现，在体外细胞培养3周后，50%以上的多肽仍留在生物印迹载体中。人DPSC在打印过程后立即生物打印的构建体中的活性>90%。茜素红染色显示骨形态发生蛋白多肽构建组的钙化程度高于生长培养基、成骨培养基和非骨形态发生蛋白多肽构建组。
此外，免疫荧光和定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析表明，牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OCN)在BMP多肽牙科结构中有较强的表达。综上所述，这些结果有力地表明BMP肽链生物墨水可以加速hDPSCs在三维生物打印牙科结构中的分化。
关键词：三维生物打印；生物墨水；牙髓干细胞；牙齿再生；组织工程
颅面损伤和相关的牙齿脱落是影响美国和全世界数百万人的重大健康问题。人工牙种植是目前黄金标准的牙齿替代疗法，然而，它们缺乏天然牙齿的许多关键特性，并且可能与导致种植失败的并发症有关。
因此，生物工程牙蕾已经被提出作为一种更好的替代牙齿替代方案。为了促进创造生物工程牙齿的努力，在组织工程和再生医学领域取得了长足的进步，创造了3D生物打印技术，能够使用各种细胞类型、生物材料和生物活性分子来生产组织结构。
这些技术能够将活细胞沉积成所需的形状或图案，以逐层方式产生复杂的组织结构。由于人体的解剖几何结构高度复杂，不容易被其他制造方法复制，3D生物打印策略在将组织工程应用转化为临床应用方面具有巨大的潜力。
在许多3D打印方法中，基于微挤压的方法是基于细胞的生物打印方法中最常见的方法。水凝胶是用于细胞生物印刷的生物墨水的主要成分，因为它们可以被修饰和配制，以提供最佳的印刷性、结构完整性和生物特性。几种由天然衍生材料制成的水凝胶，如明胶、胶原、海藻酸盐和纤维蛋白，已被广泛用于生物打印应用。甲基丙烯酸明胶(GelMA)是一种由明胶改性而成的水凝胶，易于合成，可通过紫外光交联固化。
在临床应用中，需要重复局部给药以达到达到治疗效果所需的生物活性。为了避免这个问题，我们在这里使用了一种人工合成的BMP-2模拟肽，它由天然BMP-2中存在的氨基酸序列(KIPKASSVPTELSAISTLYL)组成，它在成骨分化过程中非常活跃。这种BMP-2模拟肽的优点包括与天然BMP-2相比成本更低，并且容易合成所需的氨基酸序列，可以根据需要进一步定制。
Ji Hoon Park团队的目标是通过生物打印人牙髓干细胞(HDPSCs)和连接生物墨水的BMP模拟肽来创建一种生物工程牙科结构。假设BMP模拟肽系留生物墨水可以加速hDPSCs在生物打印的牙科结构中的分化。在这项研究中，团队使用了一种硫代化的BMP模拟肽，它直接结合到基于GelMA的生物墨水配方中，检测了生物打印牙科结构的流变性、可印刷性和结构稳定性。为了评价生物印迹牙体的生物学特性和hDPSC的分化，测量了细胞的活性和增殖，矿化组织基质的产生，并用免疫荧光和定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)分析牙髓干细胞分化标志物的表达。
将人DPSCs培养在含有440mLDMEM/F12培养基和50mLFBS(HyClone，Logan，UT，美国)、25µg/mL抗坏血酸(微孔Sigma)、5mLGlutaMAXTM补充剂(Life Technologies)和抗生素/抗真菌(A/A)(Life Technologies)的正常生长培养基(NGM)中。媒体每3天更换一次。细胞在达到约80%融合后传代。在所有实验中，人的DPSCs扩增到最大传代数为7代。或者，在含有神经生长因子和成骨补充剂(50µg/mL抗坏血酸、100nM地塞米松和10 mMβ-甘油醛-3-磷酸)的成骨培养基(OM)中培养hDPSC，以确认其分化(补充图1)。在紫外光交联过程中，硫代化的BMP模拟肽被直接偶联到GelMA水凝胶中(图1A，B)。
图1.明胶甲基化过程和BMP模拟肽与GelMA的偶联。(一)明胶是用甲基丙烯酸酐(MAA)甲基丙烯酸化生成明胶的。然后将GelMA交联，在光引发剂和紫外光照射下，合成的含有巯基(-SH)的BMP肽与GelMA结合。(B)本研究中使用的生物打印工艺的概念设计。将含有GelMA、hDPSCs和BMP-SH的生物墨水挤压生物打印，然后进行UV交联。在体外细胞培养过程中，hDPSCs分化为牙源性细胞。(C)用不同量的MAA/明胶(mL/g)合成GelMA的1HNMR分析。(D)GelMA的甲基化百分数(%)取决于MAA的用量(n=3)。(E)FITC-BMP结合的GelMA构建物的归一化荧光强度(n=3)。
在1 Hz振荡频率和0.1%振荡应变下，分析了GelMA和BMP-GelMA水凝胶在UV交联前后的流变特性(图2A，B)。GelMA和BMP-GelMA生物墨水在紫外光交联前表现出~2kPa的储能模量(G‘)，在紫外光交联后急剧增加到~4kPa。
图2.GelMA和BMP-GelMA结构的力学性能。(A)通过应变扫描测量的储能模量(G‘)和损耗模量(G“)。在有和没有BMP偶联以及交联前后对GelMA进行了测试。(B)交联前后(每组n=15)BMP偶联前后GelMA的储能模量(n=15)。(C)通过压缩试验(n=3)测量有无BMP偶联的交联GelMA的杨氏模量。(D)有无结合BMP的GelMA生物墨水的溶胀率(n=3)。(E)在有和没有BMP偶联的情况下，GelMA生物墨水随时间损失的百分比(每组n=3)。所有数据均以平均SD表示。给出了双侧学生t检验的p值。N.S.表示没有意义。
在研究团队以前工作的基础上，我们优化了GelMA基生物墨水的打印参数，并能够打印出含有点阵和固体立方体结构的hDPSCs的GelMA基构建物(图3A)。
图3.生物印迹构建物中人DPSC的活性和增殖。(A)打印代码示意图、生物打印设置照片以及打印的格子和实心立方体结构。(B)在打印后1、4、7和14天，对生物打印构建体中的hDPSCs进行活/死染色(n=3)。(C)细胞存活率百分比的量化。(D)生物印迹构建物内hDPSC的细胞增殖(n=3)。
为探讨BMP模拟肽对hDPSC分化的影响，分别在NGM、OM和OM-D中培养并分析了生物印迹的hDPSCs-GelMA和BMP-GelMA构建物在2周或4周时的分化情况。HE染色检测细胞形态和细胞外基质生成(图4A)。H&E染色结果显示，培养2周和4周细胞分布均匀，表明细胞在培养过程中在生物墨汁中保持均匀分布。
图4.三维牙科结构中hDPSCs的成骨分化。(A)H&E和(B)茜素红染色：在体外培养和生物墨水条件下，分别于2周和4周对3D生物打印牙体进行染色。(C)茜素红染色定量(n=3)。给出了双因素方差分析和土耳其检验的p值。NGM：正常生长培养基，OM：成骨培养基，OM-D：不含地塞米松的OM。
切片的GelMA和BMP-GelMA结构的免疫荧光染色被用来研究DSPP和OCN在3D生物打印的牙齿结构中的表达(图5A)。
图5.体外培养的3D生物打印牙科结构的成骨分化标志物的表达。免疫荧光染色显示(A)DSPP和(B)OCN在不同介质和生物墨水条件下2周和4周后在生物打印构建体中的表达。定量(C)DSPP和(D)OCN表达(n=3)。给出了双因素方差分析和土耳其检验的p值。NGM：正常生长培养基，OM：成骨培养基，OM-D：不含地塞米松的OM
定量RT-PCR分析是对3D生物打印的牙齿结构进行的(图6)。评估了牙源性标记物dspp和成骨标记物的表达。
图6.体外培养的3D打印牙科结构的qRT-PCR分析。(A)RUNX2，(B)COL1A1，(C)BGLAP和(D)DSPP在不同介质条件下2周和4周生物印迹构建物中DPSCs的基因表达.
在这项研究中，研究团队使用了硫代化的BMP肽，在紫外光交联过程中，它可以简单地与GelMA水凝胶中的双键偶联，从而在3D生物打印构建体中提供BMP肽的长期稳定性和有效性。FITC标记的BMP-SH的稳定性实验表明，BMP-SH与GelMA的结合稳定，孵育3周后，BMP-SH在生物印染的牙体中的存留率超过40%。此外，在UV交联前后，BMP偶联对生物墨水的降解轮廓、溶胀率或力学性能没有显著影响。无论有无BMP偶联，细胞存活率和细胞增殖率都很高。因此，通过与GelMA的简单混合，发现BMP-SH可以被加入到GelMA生物墨水中，而不会影响生物墨水的基本性能。这是一个重大的好处，因为它使生物墨水中加入BMPSH成为一个简单而直接的过程。
在这里，研究团队描述了一种新型的BMP模拟肽-系留生物墨水的开发，用于3D生物打印的生物工程牙齿组织构建。这种生物墨水配方提供了适当的印刷适宜性和牙齿特有的微环境，以支持hDPSC的分化。本研究结果表明，BMP-GelMA生物墨水配方支持hDPSC的高活性和高增殖，并加速其在三维生物打印构建物中的牙源性分化。总之，这些结果表明，3D生物打印策略与一种新型的BMP肽系留生物墨水相结合，具有创造生物工程牙齿组织结构的巨大潜力，用于未来再生医学和牙科领域的应用。