在这项研究中，Shallu Kutlehria团队设计了高通量的角膜等价物的3D生物打印，可以满足体外模型的需要。在数字3D角膜模型中，将成人角膜的平均尺寸转换成3D形状，然后转换成G代码文件，并用BIOX打印机(CelLink)打印出来。
为了保持角膜的曲度，利用立体平版印刷机设计了支撑支架。支撑支架可方便一次打印6-12个角膜，从而实现高通量打印。将人角膜基质细胞(Hcks)加入到优化的生物墨水中，打印出含有细胞的角膜基质等效物。印迹结构用100 mM氯化钙交联，用Hanks‘s平衡盐溶液洗涤，在37℃的成纤维细胞培养液中孵育。对打印的角膜进行活体死亡试验、Alamar试验以及纤维连接蛋白和肌动蛋白绿色标志物的表达分析。打印的角膜能够保持其结构、完整性和清晰度。
活体死亡试验和Alamar试验表明，HCKS在2周内保持了较高的存活率(>95%)。在打印的角膜中有纤维连接蛋白和肌动蛋白绿色的表达。综上所述，采用立体平版印刷、基于挤压的印刷和微转移模塑技术相结合，实现了3D打印角膜基质等效物的高通量制造。
关键词：3D生物打印，生物墨水，角膜，高通量，水凝胶
人的角膜是眼睛的光学窗口，是眼部药物输送的第一道生理屏障。角膜是一个高度组织化的结构，主要由I型胶原蛋白组成，分为五个不同的层。角膜基质约占角膜总厚度的80%，含有静止的角质细胞，在损伤后被激活。目前存在治疗角膜擦伤和疾病的眼科制剂，但能够准确代表人类角膜结构和成分的体外模型有限，可以在其上进行测试。因此，动物模型被严重依赖，这可能代价高昂，而且可能无法准确预测临床试验中的人类反应。传统的人眼体外模型在真实模拟眼部环境方面存在局限性，而制造这些结构的效率可能会阻碍其在眼科药物开发中的应用。
在这项研究中，Shallu Kutlehria团队设计了一种结合微转移成型的3D生物打印角膜基质的新方法，优化了生物墨水和设计质量(QBD)技术，并利用G-code以高通量的方式复制组织模型。我们的组织模型是用成人角膜基质的平均尺寸设计的，将它们转换成3D形状，可以进一步切成Gcode，然后用Bio X 3D打印机(瑞典哥德堡CelLink)打印。SLA打印机(马萨诸塞州Formlabs)制造了一种支撑支架，以帮助在打印过程中保持角膜的曲率，并塑造仅靠挤压难以实现的高分辨率特征。这种支撑支架可以促进6-12个角膜的高通量打印，并能够使用机械性能优化的生物墨水来最大限度地减少打印时间。
使用Slic3r软件将角膜STL文件转换为G代码。选择同心打印图案，在角膜底部中心设定打印原点。选择的层高为200μm，填充密度为25%。然后，该文件在Reposer-Host中被转换为G-code，以质量检查印刷运动、丢失的伪像以及数字精确模型的复制。打印6个或12个角膜的G代码是通过引入非挤压运动来在相邻的井之间导航来编写的。在打印完第一个角膜，打印头被编程为从井中上升10 mm，并在X方向上顺序移动到给定行的下一个井。打印完一行的最后一个角膜后，打印头抬起并沿Y方向移动到新的一行，开始沿相反的X方向打印。打印12个角膜的整个路径遵循如图1e所示的蛇形方式。这是我们的模板代码，可以根据模板代码改变参数，如温度、打印速度、挤出压力和第二个打印头的激活以分配交联剂。
图1：人角膜基质和基托支架装置的研制。(A)在Autodesk Fusion 360中建模的平均角膜基质尺寸。(B)支撑脚手架单井的亮场图像，显示其半径。(C)6孔角膜支架三维模型。(D)使用预制软件为12孔脚手架的SLA打印提供支持和木筏准备。(E)12孔角膜支架的打印路径。(F)使用BIOX打印机高通量打印12个角膜。(G)交联后放置在介质中的印刷角膜。(H)通过字母“C”显示透明的角膜图片。(I)第一天使用倒置显微镜拍摄的3D打印角膜的明场图像。
用于打印的台式生物打印机BiO X(CelLink)配有活塞驱动的注射头和气动打印头。采用Bio X的紫外线杀菌系统对印刷过程中的环境进行消毒。通过创建包含12个角膜的G代码文件以及定义的打印路径在每个孔之间导航，高通量打印角膜是可能的。在打印第一个模型之后，代码被设计为将打印头从井中抬出10 mm，并沿X方向顺序移动到给定行的下一个井。打印12个角膜的整个路径遵循如图1e所示的蛇形方式。这是模板代码，可以根据模板代码改变参数，如温度、打印速度、挤出压力和第二个打印头的激活以分配交联剂。
为了挤出材料，表观粘度既要低到可以容易挤出，又要高到可以在连续的层上堆叠。将粘度与增加的剪切应力绘制成曲线图，以确定配方的弹性和储存模数(图2a)。
图2：生物油墨的特性(A)使用流变仪进行流动扫描试验，以确定在不同剪切应力下的粘度。墨水2的粘度比其他墨水高。(B)剪切变稀生物墨水的剪切应力与剪切速率行为的关系。(C)与对照(水)相比，生物墨水2，3D打印角膜在不同波长的透光率
单因素方差分析显示，A、C、AC、BC、B2和C2变量显著影响黄褐色(增量)。这表明明胶浓度和温度具有二次效应，而海藻酸盐浓度具有线性效应(图3a，b)。这也表明BC和AC是双向的相互作用。明胶浓度和温度对生物墨水的tan(Delta)值有显著影响(p<0.0001)。随着明胶浓度的增加，tan(Delta)显著降低(p<0.0001)。随着温度的升高，tan(Delta)显著降低(p<0.0001)。然而，海藻酸钠浓度的增加对tan(增量)没有明显影响(图3b)。此外，在用各种生物油墨进行的初步印刷试验中，观察到，将海藻酸钠增加到3.25%可以赋予更多的硬度，并保持曲率和形状。因此，所有的责任因素都是在为创建设计矩阵而选择的范围内制定的。
图3：响应3D曲面图。(A)明胶浓度和温度对Tan(增量)的影响。随着明胶浓度的升高，Tan(Delta)显著降低，而随温度升高，tan(Delta)显著增加。(B)藻酸盐浓度和温度对Tan(三角洲)的影响。随着海藻酸盐浓度和温度的升高，Tan(增量)显著增加。(C)选择具有最大明胶浓度、3.25%海藻酸盐浓度和温度(23℃)的低棕褐色(三角洲)所需批次
PDMS角膜的扫描电子显微镜提供了打印的角膜结构的洞察力，这是由于角膜良好引起的共享印记。SLA打印的支架使角膜的前表面分辨率高达25μm(图4a，b)，而不是像其他研究中描述的那样，仅依靠喷嘴规的最高分辨率为160μm。
图4：角膜支撑支架的特征(a，b)扫描电子显微镜观察由牙科SG树脂制成的支撑支架衍生的PDMS角膜，显示SLA打印支架的前表面分辨率较高。(C)拍摄同一脚手架上两口不同井的亮场图像，以确认井的半径和两口井之间的差异
图5： 3D打印角膜支架和3D打印角膜的原子力显微镜(A)角膜座的侧面图(STL文件)，中心有圆顶以稳固地放置角膜。(B)在AFM测试过程中，角膜座盖的侧视图有孔，以露出角膜中央区域。(C)顶视SLA打印角膜座椅。(D)顶视SLA打印角膜座盖。(E)在眼盖的帮助下将角膜固定在中心位置的角膜固定器的俯视图。(F)使用原子力显微镜在10μm×10μm的扫描面积上进行3D打印角膜地形图。(G)3D打印角膜基质表面的原子力显微镜图像
活体死亡实验显示，第1天和第14天的细胞存活率分别为96±5%和86±2%(图6a，b)。Alamar实验也证明细胞在打印的角膜支架上保持了2周的活性和生长。细胞生长率以第1天的生长率计算。第5天、第10天和第14天的细胞生长率分别为101±9%、98.5±13%和93.8±7%(图6c)。
图6：3D生物打印角膜的细胞活性和免疫荧光染色的评估。(A)在第一天在3D打印的角膜中进行含有人角膜基质细胞(HCK)的活体死亡分析(合并图像)。(B)第14天3D打印角膜中携带HCK细胞的活体死亡分析(合并图像)。(C)在第1、5、10和14天对3D打印角膜进行Alamar检测。使用荧光显微镜对3D打印角膜进行(D)纤维连接蛋白(红色)、(E)F-肌动蛋白(绿色)、(F)DAPI(蓝色)和(G)合并图像的免疫荧光染色
综上所述，研究团队设计了高通量3D打印模型，并为快速打印角膜基质支架的可行性建立了概念证明。由于生物墨水中胶原蛋白、明胶和海藻酸钠的最佳比例，打印出的角膜透明、光滑，具有理想的弯曲度，并支持HCKs生长2周。本研究为高度组织化和仿生结构的优化设计提供了一条新的途径，并与组成和组件设计相结合，以获得大规模的3D打印组织。