一、前言
细胞胞吞缺陷是包括阿尔茨海默病(AD)在内的神经退行性疾病的一个标志。晚发性阿尔茨海默病全基因组关联研究中发现，多个基因提示胞吞作用是一个关键的相关风险过程。胞吞缺陷在散发性AD的临床前阶段很明显，特别是在APOE4携带者中。尽管APOE4与疾病风险之间的密切遗传关联得到认识已有20多年，但APOE4如何增加疾病风险的问题仍未得到解决。
近期，Cell Reports期刊发表了题为《PICALM Rescues Endocytic Defects Caused by the Alzheimer’s Disease Risk Factor APOE4》的研究论文，作者团队发现(1)APOE4表达干扰了细胞的胞吞作用，以及(2)PICALM可以恢复APOE4细胞的胞吞功能受损；阿尔茨海默病的胞吞功能受损最常与β淀粉样蛋白(Aβ)的合成失调或清除不良有关，这一发现可能是治疗干预的一个关键节点和潜在的靶点。
二、主要结果
1、APOE4干扰源于IPSC的星形胶质细胞胞吞作用
由于星形胶质细胞是人脑APOE的主要来源，作者使用IPSC来源的星形胶质细胞作为研究对象（图1 A）。两组细胞除APOE以外（APOE3或APOE4）的所有基因位点均相同，并验证只表达星型细胞标志物S100b和GFAP （图1B），不表达其他可能污染细胞类型的标志物。然后系统地监视了两组细胞胞吞途径的多个阶段（图1C）。
首先检测了Rab蛋白和Rab效应器蛋白的免疫荧光染色，它们专门标记早期、晚期和再循环的内含体。使用针对早期内含体相关蛋白Rab5和EEA1的免疫荧光探针直接观察早期内含体的数量，观察到与APOE3星形胶质细胞相比，APOE4中Rab5阳性和EEA1阳性的星形胶质细胞的数量都减少了(图1D-1F)，表明早期的胞吞作用受到影响。
作者为了确定观察到的早期胞吞囊泡积累的差异是否导致早期胞吞作用中的功能缺陷，使用荧光标记的配体(表皮生长因子[EGF]和转铁蛋白[Tf])来检测网状蛋白介导的胞吞早期阶段，通过将细胞暴露在5分钟的荧光EGF脉冲中，直接观察到早期胞吞机制所吸收的EGF(图1C、1G和1H)。
ApoE4星形胶质细胞倾向于胞吞少量的EGF(图1G和1H)。利用荧光标记的Tf，再次观察到APOE4星形胶质细胞比APOE3星形胶质细胞胞吞Tf少。总体而言，APOE4星形胶质细胞的早期胞吞比率低于APOE3星形胶质细胞(图1G和1I)。
图1.表达ApoE4的iPSC来源的星形胶质细胞在早期胞吞功能表现出缺陷
2、酵母菌APOE模型显示人类星形胶质细胞中的胞吞异常
为了更详细地探讨APOE4对胞吞作用的影响，作者构建了面包酵母菌APOE生物学的模型。该酵母模型在已知的基因组位点上包含稳定整合的结构，并受雌二醇诱导启动子的控制，表达人APOE亚型（图2A）。
在APOE4酵母模型中，早期内含体确实是异常的，与APOE3酵母相比，该模型显示内源性标记的Rab5同源物YPT5和VPS21(图2B和2C)的水平和定位被破坏。虽然观察到人IPSC来源的APOE4星形胶质细胞中Rab5和EEA1的表达减少(图1D-1F)，但在APOE4酵母中酵母同系物的水平增加(图2C和2D)。这表明细胞类型可以极大地影响APOE4缺陷，酵母模型也可能反映了多种人类细胞类型。
为了专门监视早期的胞吞作用，作者在表达APOE3和APOE4的酵母中，使用了定量逆转酶试验来评估胞吞效率。这项检测使用了由胞外蔗糖转化酶、酵母蛋白Snc1p和胞内GFP组成的跨膜嵌合蛋白受体(GSS)。由于胞吞作用受损，GSS在细胞表面堆积导致转化酶活性增加，而胞吐或循环缺陷则导致细胞表面GSS减少，从而降低转化酶活性。胞吞效率是通过比色读数的酶分析来评估(图2D)。
作为对照，一个关键的早期胞吞因子SLA1的缺失导致细胞表面GSS增加，因此有更高的转化酶信号(图2E)。与APOE3或野生型酵母相比，表达ApoE4的酵母的转化酶信号明显增加(图2E)。因此，酵母APOE4模型反映了胞吞过程中的干扰，特别是胞吞过程中的破坏，类似于在人IPSC来源的星形胶质细胞中观察到的那样，因此酵母模型可以作为一种工具来识别可能改变APOE4这一效应的遗传和化学因素
图2. APOE4相关胞吞缺陷酵母模型
3、PICALM酵母同源基因YAP1802逆转APOE4诱导的细胞胞吞功能受损
作者发现在酵母模型中，生长缺陷伴随着APOE4诱导的胞吞作用的紊乱(图3A、3B)，而APOE3并未导致生长缺陷(图3A、3B)。接着，作者对对APOE4诱导的生长缺陷的抑制子进行了筛选，分析了34种参与细胞内转运所有阶段的蛋白质。
当过表达时，只有Yap1802p显著影响APOE4酵母生长表型(图3C，黄色突出显示)，作者检测了Yap1802p的过表达是否可以改变Rab蛋白中观察到的失调。Yap1802p表达的增加使在表达APOE4的菌株中观察到的Rab5同源基因的累积水平降低到APOE3水平(图3D)。Yap1802p表达的增加也使Vps21p(Rab5同源物)的定位恢复到APOE3模式(图3E)。
最后作者假设Yap1802p修复生长缺陷的同时是否伴随着APOE4诱导的早期胞吞缺陷的修复。经过证实，Yap1802p的过表达导致GSS转化酶信号显著降低，表明Yap1802p的表达可以功能性地修复APOE4诱导的转运缺陷(图3F)。
图3.提高YAP1802的表达可挽救酵母中ApoE4相关的胞吞缺陷
4、PICALM过表达对APOE4诱导的IPSC来源星形胶质细胞胞吞作用的影响
APOE4酵母模型表明，YAP1802是APOE4诱导的胞吞缺陷的强有力的遗传修饰物。YAP1802的人类同源基因是PICALM，它本身与AD有关。因此，作者研究了PICALM是否可以改变IPSC来源的人星形胶质细胞的APOE4表型。
确认PICALM在APOE3和APOE4星形胶质细胞中的内源性表达没有显著差异后，作者用慢病毒处理APOE3和APOE4星形胶质细胞，该慢病毒在星形胶质细胞特异性GFAP启动子下驱动血凝素(HA)标记表达PICALM(PICALM-HA)(图4A和4B)。由于修改胞吞作用可能会增强或降低蛋白质的内化、循环或降解速率(，作者证实PICALM的表达不会改变APOE水平(图4C和4D)。
为了研究PICALM过表达对APOE4诱导的胞吞过程的影响，作者再次使用荧光配体EGF和Tf作为早期胞吞过程的探针。作者发现PICALM的过表达增加了EGF摄取(图4A、4E和4F)和Tf摄取(图4G和4H)，这表明早期的胞吞能力得到了恢复。
图4.增加PICALM表达修复APOE4诱导的IPSC来源星形胶质细胞胞吞损伤
三、小结
风险的具体机制，为其成为AD等神经退行性疾病的潜在治疗靶点提供更多的证据支持。该研究确定了PICALM是APOE4相关缺陷的遗传修饰物。并且提示鉴于PICALM与APOE4在胞吞作用上的共同作用，靶向这一细胞通路可能成为潜在的治疗途径。
编译作者：文玉 (Brainnews创作团队)
校审： 胖兔子可可、Simon (Brainnews编辑部)