骨是一种高度血管化的组织，在骨骼发育过程中，血管化和矿化是同步进行的。事实上，这两种成分都应该包括在任何可靠的和贴壁的体外模型平台中，以研究骨生理学和骨骼疾病的发病机制。为此，Irene Chiesa团队利用明胶纳米羟基磷灰石(Gel-nHA)3D生物打印支架，建立了体外血管化骨模型。
首先，研究团队将人骨髓间充质干细胞(HMSCs）接种到支架上，进行了两周的成骨分化。然后，他们将慢病毒-绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉内皮细胞(HUVECs）植入3D生物打印支架大孔中，在接下来的两周培养中形成毛细血管样网络。
实验分为三个实验条件：条件1，人脐静脉内皮细胞在1：1成骨培养基（OM)：内皮细胞(EM)中培养的骨构建物；条件2，不含人脐静脉内皮细胞的骨构建物在1：1OM：EM中培养；条件3：人脐静脉内皮细胞骨构建物在1：1生长介质：EM中培养。所有样本均为工程化骨基质。
在条件1和条件3中，人脐静脉内皮细胞在骨结构内形成管状结构，在活组织和组织学中可以通过荧光显微镜看到复杂的毛细血管样网络的组装。CD31免疫染色证实有明显的血管腔形成。实时定量PCR定量检测成骨分化和内皮细胞反应。碱性磷酸酶和矮小相关转录因子2的上调证实了hMSCs的早期成骨作用。即使在条件3下去除OM，他们也观察到明显的成骨，明显伴随着骨桥蛋白、血管内皮细胞生长因子和I型胶原的上调。
这些发现表明，研究团队在短短四周的培养中就成功地实现了一种具有强大血管化能力的骨模型，我们强调了内皮细胞的包涵体是如何更真实地支持成骨的。本文报道的方法导致了一种受生物启发的体外骨血管形成模型，模拟了组织发育过程中发生的毛细血管的从头形态发生。
关键词：血管化骨模型、三维微生理系统、三维生物打印、生物材料。
在天然骨中，血管对骨的发育、重建和骨折愈合是必不可少的，对维持健康的骨组织也是至关重要的。血管生成是骨形成的先决条件，在膜内骨化过程中，毛细血管侵入分化的间充质区，而在软骨内骨化过程中，肥大的软骨细胞招募渗入的血管系统。骨和血管之间相互作用的调节失调是不同病理（如缺血性坏死、骨质疏松症和Gorham-Stout病）的基础。
此外，骨组织工程体内移植的一个关键障碍是工程化结构内缺乏血管形成。血管化骨植入物可以有效地治疗连接结构和宿主血管网络的大型骨缺损，以维持生存能力并促进整合。此外，血管系统也是在体外工程骨平台研究骨生物学、疾病发病机制和测试新的潜在药物时需要包括的一个关键因素。
在过去的十年中，通过结合成骨前体细胞和血管前体细胞，人们进行了不同的尝试来生成体外血管化的骨组织结构。共培养系统经常被用来同时促进成骨和血管生成。值得注意的是，在正信号反馈回路中，细胞间通讯支持骨组织工程中同时发生的成骨和血管生成。
事实上，人骨髓间充质干细胞(HMSCs）分泌血管生成生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF)和血小板衍生生长因子（PDGF)，促进血管生成；而内皮细胞(ECs）产生骨形态发生蛋白(BMPs），促进前体骨细胞向成骨细胞分化。然而，共培养方法是复杂的，细胞类型、培养介质、微环境、接种方法、支架结构和材料等参数将对最终结果产生重大影响。
在过去的十年里，生物打印越来越多地被用于支架的制造，以提供对支架设计的更多控制。生物印花使用计算机辅助转移过程来快速制造预定义的复杂结构，并精确控制外部和内部结构。因此，与传统技术不同的是，生物打印能够精确地制造相互连接的多孔结构，控制支架制造中的关键因素，例如组成、孔几何形状、大小和互连性，这些因素对于创建具有不同细胞类型的有组织的构建物是必不可少的。
在这项工作中，研究团队的目标是建立一种体外工程化的血管化骨模型，以研究血管形态发生和成骨在结构发育过程中的相互影响。为此，团队首先实现了一种基于明胶-纳米羟基磷灰石(Gel-nHA)三维生物打印支架的骨构建，该支架具有相互连接的孔隙网络，种植了经过成骨分化的hMSCs。然后，为了简单起见，他们将慢病毒-绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉内皮细胞（以下简称HUVECs）纳入3D生物打印支架孔内，形成一个毛细血管样网络。
图1：(A)用于制造支架的活塞驱动挤出机3D生物打印机。(B)用于打印具有垂直和侧向孔隙的木桩支架的生物标绘技术示意图；在打印过程中，牺牲支持材料为生物材料墨水提供支撑，以避免支架坍塌。(C)在Solidworks中设计的木桩脚手架CAD模型，带有横向分支，可防止在非打印移动过程中材料沉积；比例尺=1 mm。
图2：骨支架的后处理。(a-c)支架在支架材料中放置48小时。照片拍摄(A)刚打印完，(b，c)48小时后，在交联之后。颜色的变化是京尼平-明胶反应的结果，深蓝色标志着交联的结束。(d，e)去除Pluronic acid F-127并用外科刀片切割侧枝后的支架。(F)脚手架直径4毫米的圆柱形芯子。(g-i)岩心在(g，h)顶面和(I)侧面的高倍率图像，分别显示轴向和侧向孔隙。G和I，比例尺=1 mm；h，比例尺=500微米。
血管化骨构建：将人脐静脉内皮细胞、人骨髓间充质干细胞制成4：1比例的悬液，最终浓度为106个/ml，用纤维蛋白凝胶和GelMA配制成1：1的溶液。在每个支架的大孔中填充55l的HUVECS：载hMSCs的GelMA-Fibin凝胶水凝胶，在紫外光(405 Nm)下原位交联2min。制造工艺示意图如图3a所示。
图3：(A)将HUVECs添加到骨构建物中，填充支架内整个相互连接的孔隙网络的过程示意图。(B)血管化骨结构发展的实验时间表（条件1和3)和非血管化对照（条件2)。
为评价支架的形态，采用显微CT技术获取支架横截面图像。不同生物打印方向的层之间看不到塌陷（图4a-b)。由ITKSnap进行的支架3D重建如图4c所示。
横截面图像用室内开发的Matlab脚本进行处理，以创建代表孔隙网络的支架微CT扫描的负片3D重建（图4d)。Matlab分析表明，支架孔网络是相互连通的，轴向方形孔径为0.92±0.14 mm，横向孔径为0.5±0.15 mm，孔隙率约为60%。
图4：(a，b)不同高度取芯支架的MicroCT切片扫描，取芯支架周长突出显示。(C)使用ITK-Snap对支架进行三维重建。(D)由Matlab获得的支架内相互连接的孔隙网络的三维重建。
在37°C的PBS 1X中进行了溶胀试验，样品在不改变其原始形状的情况下吸收了水。体重在30分钟后达到平台期（图5a)。对支架进行后处理和膨胀后的压缩试验，压缩模量分别为36.4±9.6kPa和5.1±2.3kPa（图5b)，复水后压缩模量明显下降。
图5：(A)随时间变化的肿胀百分比。重量平台点(30分钟）用红线突出显示。(B)后处理后测试的支架的压缩模量与复水（膨胀）后测试的支架的压缩模量之间的比较。*p值<0.001。
支架接种人骨髓间充质干细胞（每个支架1×105个细胞），24小时、72小时、7天、10天后进行活细胞检测。由于京尼平是红色荧光，所以不可能进行标准的活/死检测中的死亡成分。图6显示了每个时间点的支架顶部、横截面和底部表面的图像。24小时后，细胞不均匀地附着在支架上，并且可以看到几个细胞聚集体。培养7d和10d后，支架被hMSCs完全均匀覆盖。
图6：支架在不同时间点上（左）、横截面（中）和下（右）表面的活体化验。24小时后，细胞不均匀地附着在支架上，可见几个细胞聚集体（红圈）。72h后细胞均匀分布，7d和10d后支架被hMSCs完全均匀覆盖。比例尺=2 mm。
10d后进行DAPI-Phalloidin染色。绿色、蓝色和红色通道分别用于显示细胞骨架、细胞核和支架纤维（图7)。观察到细胞横跨支架的角落，并开始填满大孔内的空隙。
图7：转基因培养10天后的DAPI-Phalloidin染色。照片是用立式立体显微镜（奥林巴斯SZX16)在不同放大倍数下使用所有通道采集的，并与ImageJ合并。红色通道：支架纤维（由于染料木素的自身荧光）；蓝色通道：细胞核；绿色通道：细胞骨架。红色虚线标出了脚手架。比例尺=500μm。
在接种24小时和14天后，在不需要任何额外染料的情况下，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白HUVECs的组织（图8a)。24小时后，HUVECs是圆形的，没有连接，就像在水凝胶中种植后所预期的那样。到了第14天，它们形成了复杂的相互连接的毛细血管样网络（图8b)；实验条件1和3的网络之间没有明显的质量差异。
图8：(A)在实验条件1中种植24小时和14天后骨组织中的HUVECs组织的比较。在24小时内，HUVECs很少，圆形且没有组织，而在第14天，它们在支架的大孔内和支架纤维上都排列成毛细管状网络。(B)以两种不同的放大倍数放大实验条件1和3的HUVECs网络图像。两种实验条件下均可形成毛细管状网络，且无质的差异。(A)刻度尺=2毫米，(B)刻度尺=500μm。
H&E染色显示hMSCs来源的成骨细胞和血管形成的人脐静脉内皮细胞之间的细胞形态（图9)。由于纳米羟基磷灰石的存在，凝胶-纳米羟基磷灰石支架染成了深紫色。然而，这并不能掩盖骨样基质的沉积，这种基质染成粉红色，在所有实验条件下都清晰可见。此外，HUVECs不仅在支架大孔内形成了毛细血管样网络，而且在实验条件1和3中呈现清晰可识别的管腔（图9)。在这些情况下，管腔的数量和大小没有明显的质量差异。当人脐静脉内皮细胞不存在时（实验条件2)，成骨分化的人骨髓间充质干细胞是唯一存在的细胞。这些细胞仍然靠近支架表面，在填充大孔的水凝胶中看不到管腔。
图9：在不同放大倍数下所有实验条件下构建物的H&E染色。骨样基质在所有实验条件下均可见（箭头）。在实验条件2中，大孔内不存在管状结构，因为水凝胶中没有人脐静脉内皮细胞，只有均匀分布的分化的人骨髓间充质干细胞。在实验条件1和3中，支架大孔中可以清楚地看到由人脐静脉内皮细胞形成的管状结构和管腔。
CD31免疫组织化学进一步证实了实验条件1和3中HUVEC管腔的形成（图10)。实验条件2作为对照，正如预期的那样，没有细胞染色，因为没有人脐静脉内皮细胞加入到水凝胶中。
图10：所有实验条件下构建物的CD31免疫组织化学。在实验条件1和3中，支架大孔内的HUVECs染色证实了HUVECs形成管腔。在实验条件2中，由于未加入人脐静脉内皮细胞，因此未见染色。
图11：用实时定量聚合酶链式反应分析血管化骨结构的基因表达。报告了所有时间点和实验条件。*=p值<0.05，**=p值<0.01。
在这项研究中，研究团队证明了序贯诱导方法能够在相同的培养空间内实现血管-成骨的结果。首先，他们促进了种植在三维生物打印凝胶-纳米羟基磷灰石支架中的hMSCs的成骨。然后，在载人脐静脉内皮细胞的水凝胶中诱导形成了稳定的血管网络，填充了支架的大孔。
这一方法产生了一种受生物启发的体外骨血管模型，模拟了组织发育过程中毛细血管的从头形态发生。生物打印的体外血管化骨模型可以用来在健康和病理条件下询问骨生物学，并测试潜在的治疗方法。这里报道的方法代表着朝着创建更真实的模型迈出了重要的一步，该模型可能包括其他类型的细胞，如破骨细胞或骨细胞。
此外，血管化骨性结构的一个自然发展是它与软骨相结合，创造了一个名副其实的骨软骨模型，以探索软骨、骨和血管系统之间发生的复杂的串扰。