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正常胰岛β细胞分泌胰岛素使血糖维持正常水平。β细胞的破坏和功能异常会导致糖尿病发生，然而目前并没有疗法能够直接修复β细胞的数量与功能。干细胞诱导分化至可移植的胰岛β细胞有望成为新型糖尿病细胞疗法。此外，干细胞分化系统也是研究人类胰腺发育的理想工具，该系统可以在很大程度上模拟体内胰腺发育的关键发育阶段。
但是，当前用于诱导β细胞分化的方案仍然具有一定局限（i）分化产生异质细胞群；（ii）在不同的hESC或iPSC品系之间，分化效率可能存在很大差异。（iii）在分子和生理水平上，所得的β样细胞仍不完全等同于原代β细胞。
诱导β细胞分化过程中涉及多样的分化谱系与异质的细胞群体，我们仍然缺乏细胞分化路径选择的全局分子图景，因此仍然难以有效控制分化过程 （例如非内分泌谱系中的未知分子事件可能会显著影响分化效率）。
2020年11月30日，来自凯斯西储大学医学院的李妍团队和靳伏铼团队联合在Nature Metabolism上发表题为Single cell lineage analysis reveals extensive multimodal transcriptional control during directed β-cell differentiation的研究论文。该工作使用人类胚胎干细胞定向诱导胰岛β细胞体外分化并使用单细胞RNA 测序技术（Drop-Seq）重建完整分化谱系树，从而系统地揭示了分化程序和谱系分支。该研究鉴定了细胞分化路径选择的 “开关” 基因，并据此优化了现有诱导分化方案、揭示了影响分化效率的分子机制。值得强调的是，该研究发现在β样细胞分化主干路径上，有大量基因呈现表达 “双峰”，表明这些基因在分化过程的不同时间被激活多次并可能行使差异功能。
团队使用人类胚胎干细胞品系H1进行分化，其特点是β细胞分化产量中等，细胞异质性高，这提供了足够的细胞群体覆盖率以分析完整细胞命运选择。该研究使用单细胞RNA 测序技术（Drop-Seq）在分化过程中选取12个时间点（跨越31天）进行实验，并获取95,308个单细胞转录组数据（图1a-c）。
研究人员首先在单细胞水平比较了干细胞诱导细胞群与原代胰岛细胞，发现干细胞诱导α样和β样细胞在转录组水平高度相似于人类原代α和β细胞 （图1d-f），并且表达近似水平的荷尔蒙基因（胰岛素基因 INS和胰高血糖素GCG）。但是进一步分析显示仍然有上百基因相较于原代细胞差异表达， 例如PAX4基因的过表达以及MAFA基因的表达不足（图1g-h）。过表达基因多富集于肝组织发育相关功能(肝组织与胰腺在胚胎发育时空上相近)，而低表达基因则富集于分泌泡相关功能（敏感的分泌功能是成熟β的标志），这表明干细胞诱导β样细胞仍需进一步体外成熟 （图1i-j）。
图1诱导胚胎干细胞至β样细胞分化单细胞转录组图谱
为解析细胞间的分化关系并重建分化过程，研究人员开发新算法重构了具有高度分支结构的胰岛分化谱系树，根据在分化谱系树上的时空表达关系，研究者将所有基因分为64个表达模块，每个模块包含约两百个基因。例如，该分析鉴定了早期干细胞模块、内胚层发育模块、胰腺内分泌发育模块、胰腺非内分泌发育模块等（图2a）。根据重构的谱系树，团队研究了β样细胞分化主干路径并鉴定了6872基因在不同时间出现单一表达峰（图2b），其中769个为转录因子，研究者进一步分析了H3K27ac ChIP-seq并发现转录因子DNA的结合基序在表观遗传水平显示一致的单峰激活， 这表明大量基因调控具有高度时序特异性（图2e）。进一步与糖尿病全基因组关联分析（GWAS）整合发现，有大量糖尿病相关基因富集于分化时序中段，表明有许多糖尿病基因有可能在早期胰岛发育过程中发挥作用（图1d）。
图2:胰岛分化谱系树基因表达时序分析
为了阐明分化效率机制，研究人员系统比较了胰腺内分泌分化路径与非内分泌分化路径。该分析鉴定了约两千个在分化路径选择上有显著表达差异的 “开关“基因（图3a-b）。内分泌路径主要上调表达分泌、胞吐、钙离子通道相关基因，而非内分泌路径主要上调消化系统、上皮细胞分化等相关基因（图3c）。
图3: 细胞分化路径分析鉴定 “开关”基因
在这些分化路径开关基因中，转录因子尤为重要。该研究鉴定了主要胰腺内分泌路径转录因子，包括已知的PDX1、NEUROG3、RFX3、NEUROD1、PAX4基因等（图3d）。HES1基因是在非内分泌路径上显著上调表达的 “开关” 转录因子（图3d, 4b）。已知HES1 是NOTCH 信号通路的下游转录调控因子，并且NOTCH基因也在非内分泌路径上显著上调（图4a）。研究者因此猜想HES1的特异表达可能促进非内分泌而抑制内分泌分化路径（β样细胞位于该路径终端），于是团队利用CRISPR-Cas9技术建立HES1-KO稳定干细胞系并发现HES1敲除确实显著提高内分泌细胞分化（图4c）。此外，根据HES1 在谱系树上的表达时间，研究者优化了NOTCH 信号通路抑制时间并成功提高分化效率（图4d-e）。
图4: 基于HES1表达时序优化内分泌细胞分化效率
此外，研究者还阐明了另一种促分化效率因子 ROCKII 抑制因子的分子机制并建立了最优抑制时间。研究者发现ROCKII 抑制因子特异性下调了非内分泌细胞的生长与增殖相关的基因进而特异性抑制了非内分泌谱系从而促进了内分泌细胞比例（包括终端β样细胞）（图5）。
图5: ROCKII 抑制因子通过抑制非内分泌细胞分化路径促进内分泌细胞分化
尤其有意思的是，在β样细胞分化主干路径上，研究者发现多达2200个基因具有表达双峰，并且这些基因的启动子活性（根据H3K27ac ChIP-Seq）也显示类双峰样波动，这表明有大量基因可能在不同时间被激活多次并可能行使有差异的功能（图6a-b）。研究者发现有相当数目的双峰基因只在内分泌谱系被二次激活，表明被二次激活的基因具有功能特异性（图6c-d）。此外，研究者还发现双峰基因的二次激活常伴随着时序特异性的不同增强子（图6e-l）。
图6: 鉴定β细胞分化过程中双表达峰基因，其双表达峰由时序特异性增强子和启动子驱动
TCF7L2 基因显示典型的双峰表达（图7a）。值得强调的是， TCF7L2 是目前和糖尿病关联性最高的基因之一，但是其影响疾病风险的机制尚不清楚。该分析显示，TCF7L2 首先在干细胞内表达，短暂下调后于胰腺祖细胞被重新激活。研究者发现TCF7L2的二次激活受一个高度时间特异的增强子E4调控，并且该增强子位于糖尿病高风险的连锁不平衡遗传区（图7b）。E4增强子敲除导致TCF7L2的第二表达峰消失（图7c-e）并导致胰岛内分泌细胞增多（图7f），这提示位于TCF7L2的遗传多态性可能通过影响胰腺发育过程造成不同程度的糖尿病风险
图7: 时序特异性增前子于TCF7L2区域驱动其于胰腺祖细胞激活表达
总之，该研究对干细胞诱导分化β样细胞进行了单细胞水平的转录组以及基因调控研究，该研究提供分化过程完整时序基因表达数据并重构了多分枝样谱系树。通过分析发现分化路径选择机制并提高了分化效率。该发现为有望推进糖尿病干细胞疗法并为糖尿病致病机理提供分子依据。
凯斯西储大学医学院李妍、靳伏铼为本文共同通讯作者，博士生翁琛、博士后席甲甲为本文共同第一作者。
https://www.nature.com/articles/s42255-020-00314-2
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