打开

Science | 揭示与自闭症风险基因相关的神经元和神经胶质异常

subtitle
BioArt 2020-11-27 22:28

解读 | 章台柳

责编 | 酶美

人类遗传学研究发现复杂的人体疾病和数千个基因位点的遗传变异具有相关性。而全外显子测序(WES)分析揭示出大量与神经发育疾病风险相关的新的功能丧失变异,包括自闭症和神经发育迟缓(ASD/ND)【1】,与全基因组关联研究(GWAS)确定的常见变异相比,这种新发现的风险变异通常具有较大的效应效能、较强的渗透性,并且发生在基因编码区域,因此为疾病建模和机理研究提供了非常关键的切入点。

然而,研究的难点在于如何确定这些风险基因中每一个基因的作用。例如,ASD/ND是由大量具有高度异质性基因贡献的神经发育障碍,包括数百个高度渗透的新发风险变异基因【2】。这些基因编码的蛋白在功能上具有多样性,很难对其发挥作用的潜在脑细胞类型、发育过程和神经发育过程中分子途径进行预测【3】。这些风险基因中很少有在动物或细胞模型中被研究,因此它们在脑发育过程中的作用尚不清楚。构建单个基因敲除动物来进行功能研究,需要耗费大量的人力和时间,因此非常需要开发大规模、通用、高分辨率的表型分析方法,来鉴定体内遗传扰动对组织和细胞特异性的影响。

2020年11月27日,来自Broad研究所的Xin Jin、Aviv Regev、张峰Paola ArlottaScience杂志发表文章In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes,研发出一种体内大规模遗传功能研究技术Perturb-seq:首先利用CRISPR-Cas9在35个ASD/ND新发风险基因中引入移码突变,随后转染进子宫内发育的小鼠大脑中,然后对出生后大脑中受到干扰的细胞进行单细胞RNA测序。测序分析从神经元和胶质细胞类中鉴定出细胞类型特异和进化保守的基因模块。这些风险基因的扰动会影响到神经发育过程中反复出现的基因模块和细胞类型,证明这些风险基因对关键细胞过程的影响。很多基因变异在不同的细胞或组织器官里往往能有不同的功能,但传统的bulk analysis往往隐没了这些基因在少数的细胞的功能。作者建立了活体内的Perturb-seq系统,在一个发育胚胎中引入基因编辑来敲除疾病相关的基因,然后两周后在发育后的脑细胞里进行单细胞测序。用这个高通量方法一次性检测了35个自闭症基因,并且检测他们在不同的脑细胞态里的功能。

研究人员从近期发表的WES研究结论中挑选广泛的神经发育障碍类别中ASD/ND患者特有的新发变异,共38个ASD/ND候选基因(由于分析标准,最终保留下35个)。这些基因具有在人脑组织表达、在多种类型细胞表达等特点,需要规模化的方法去研究其在不同细胞类型和发育事件中的基因功能。研究人员开发出in vivo Perturb-Seq的技术。具体地说,首先使用一个组成性表达Cas9的转基因小鼠,通过慢病毒感染将针对不同风险基因的gRNAs输送到子宫内发育不全的胚胎侧脑室。每个慢病毒载体包含靶向一个ASD/ND风险基因的5编码外显子的两个不同的gRNAs(提高敲除效率)和一个BFP报告蛋白-条形码。随后在小鼠出生后7天(P7)分选BFP+细胞进行单细胞RNA-seq,通过条形码识别受干扰的细胞及对应的风险基因,同时分析细胞表达变化。结果显示Perturb-seq载体在大脑皮层的各种神经元和胶质细胞中都有表达,这便于在不同类型细胞中分析每一个风险基因的功能。

打开网易新闻 查看更多图片

下面的分析中作者又利用Louvain聚类方法定义出5个泛细胞群:皮质投射神经元、皮质抑制神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞。筛选出携带单基因突变的细胞进行下一步分析,大部分ASD/ND风险基因干扰对这五种主要细胞类型的存在和比例的影响较少,只有Dyrk1a缺失对细胞组成有显著影响,增加少突胶质细胞的比例,减少小胶质细胞和巨噬细胞的比例。对五大类细胞中共有的基因模块进行定义,发现ASD/ND风险基因干扰对现有的GO类型并没有显著影响。利用加权基因相关网络分析(WGCNA)和结构主题建模(STM)两种方法分别在五大类细胞中定义新的基因模块,筛选出WGCNA定义的14个基因模块,其与STM中一个或或个主题高度相关。这14个模块有两大类:一些反映了常见的生物学过程,存在于多个细胞亚群中;另一些代表了仅存在于某些亚群的细胞类型特异性特征。计算ASD/ND风险基因扰动对这些基因模块的影响,发现Adnp、Ank2、Ash1l、Chd8、Gatad2b、Pogz、Scn2a1、Stard9和Upf3b等9个基因的扰动对五种基因模块有显著的影响,其中Ank2对Ndnf+中间神经元相关模块(IN1)的调控在单基因突变/干扰实验中所验证。而Chd8和Gatad2b扰动显著下调少突胶质细胞的ODC1基因模块,ODC1基因模块与少突胶质细胞的成熟有关。构建Cdh8杂合突变小鼠,原位杂交发现出生7天后小鼠的皮质中2个经典的少突胶质细胞前体细胞(OPC)标记物Cspg4和Pdgfra的表达显著下调;发育后期,OPC细胞数目并没有变化,但MBP+(髓鞘少突胶质细胞的标记物)细胞显著增加,即Cdh8扰动加速出生后MBP含量的增加,这与in vivo Perturb-Seq得到的结论类似。

最后,研究人员对现有的人类组织(包含成人大脑皮质、ASD供体皮质和匹配对照组、胎儿人类皮质以及3个月、6个月大的人脑类器官)的scRNA-seq和snRNA-seq数据进行分析,发现14个基因模块都在人类数据是保守存在的,其中8个模块显示出更多的模块内相关性,而且相关性也随着人类样本的年龄而增加。那么,小鼠Perturb-Seq中观察到的效应是否与ASD病人死后脑区中变化相似?利用现有的数据集定义出ASD病人中不同类型细胞中差异表达的基因,并且在小鼠中有1:1同源类似物的基因共14个。分析显示中间神经元的SST和兴奋性神经元的NRN1在ASD病人中表达降低,与Perturb-Seq试验中表达显著减少相一致。这表明Perturb-Seq实验可以鉴定出人类ASD病人中存在的基因表达异常。

总的来说,研究开发了体内规模化研究基因功能的新技术in vivo Perturb-Seq,可用于探究在复杂组织中同时研究多种基因在多种细胞类型中的功能,为复杂疾病的研究提供了有力的工具。

https://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.aaz6063

制版人:嘉

参考文献

1.F. K. Satterstrom et al., Novel genes for autism implicate both excitatory and inhibitory cell lineages in risk. Cell180, P568 (2018).

2.J. A. Chen, O. Penagarikano, T. G. Belgard, V. Swarup, D. H. Geschwind, The emerging picture of autism spectrum disorder: Genetics and pathology. Annu. Rev. Pathol.10, 111–144 (2015).

3.C. Mullins, G. Fishell, R. W. Tsien, Unifying views of autism spectrum disorders: A consideration of autoregulatory feedback loops. Neuron 89, 1131–1156 (2016).

特别声明:本文为网易自媒体平台“网易号”作者上传并发布,仅代表该作者观点。网易仅提供信息发布平台。
帮他点赞
大家都在看打开应用 查看全部
网易热搜每30分钟更新
打开应用 查看全部
打开