2020 年 10 月，Emmanuelle Charpentier 与 Jennifer Doudna 因为在「魔剪」CRISPR 用于基因编辑的原创性工作获得了诺贝尔化学奖。
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此时，离她们关于「魔剪」最重磅论文的发表，才仅仅过去 8 年。虽然 CRISPR 因其方便好用著称，如此短的发展历史，意味着这项技术还有极大的提升空间。
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By Maya Kostman
在 CRISPR-Cas9 系统中，Cas9 核酸内切酶需要与一段长度约为 100 核苷酸的 Guide RNA（gRNA）的形成复合物，并在 gRNA 与目标序列结合的引导才能进行基因编辑。
要高效、准确地使用「魔剪」进行基因编辑，最首要的任务就是设计一个出色的 gRNA。
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2020 年 11 月 5 号，Nature 子刊Nature Methods刊登了其编辑Vivien Marx所撰写的，题为 Guide RNAs: it’s good to be choosy 的评论文章 [1]，重申了 gRNA 选择的重要性，并为 gRNA 的选择，提供了最新的指引。
gRNA 的组成
虽然统称为 gRNA，但在自然界中，细菌的 gRNA 是由 crRNA（CRISPR RNA）与 tracrRNA（trans-activating crRNA）组合而成的。
crRNA 上的间隔区（spacer）负责与名为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif, PAM，通常为 NGG 序列) 下游的 20 个碱基互补。当 CRISPR-Cas9 定位到 PAM 和互补序列后，Cas9 酶就一举将目标剪短，造成双链断裂（DSB, double-stranded breaks），这细菌利用 CRISPR/Cas9 系统在自然界对抗病毒的原理。
除了 Cas9 之外，其他一些 Cas 酶也被发现具有不同的剪切特性。比如不含 tracrRNA 的 Cas12a 就可以识别除 NGG 之外的多种 PAMs。
病毒的 DNA 断裂后意味着病毒的死亡，但在更高等的生物中，一次小小的断裂并不足以致命。因为很多细胞有着修复 DBS 的能力。在高等动物中，名为非同源末端连接（non-homologous end joining ，NHEJ) 与同源重组 (Homology directed repair , HDR) 的修复能力，能够帮助我们抵御 DNA 损伤所带来的危害。
也正是这两种保护机制，使得张锋等人发现了 CRISPR-Cas 基因编辑的潜力。
在 CRISPR-Cas 系统创造 DBS 后，NHEJ 与 HDR 系统会将中断的 DNA 连接起来，我们也因此可以实现基因的敲出与敲入。根据修复机制的选择情况，科学家们提出了不同的 gRNA 设计策略，以此保证基因编辑的高效性以及准确性。
NHEJ 机制下的 gRNA 选择
NHEJ 的修复机制下的基因编辑像是一把「锤子」。
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通过剪断 DNA，CRISPR-Cas 系统会在目标序列中创造一个得失位（indel），无论得失位在目标基因的编码区还是非编码区，都足以导致基因序列的移码，并以此导致该基因被失活敲除。
在选择 NHEJ 修复机制基因敲除的 gRNA 时，第一原则是避免目标序列在蛋白的 N 端，以降低细胞利用位于附近的启动子重启基因的可能。
此外，也应该尽量避免在目标蛋白的 C 端选择 gRNA，以免敲除后产生的等位基因依旧具有功能。
在这种情况下，如果我们在目标蛋白的编码序列 5% 到 65% 的区域中进行编辑，由于每 8 个碱基中就会出现，我们依旧会有大量的备选项，所以具体如何选择，Nature Method也给出了建议，后文中我们会进一步介绍。
HDR 机制下的 gRNA 选择
比起锤子来说，HDR 机制下的基因编辑更像是「拼图」。
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与锤子不同，使用 HDR 进行编辑时，需要同时在系统中引入一定量的同源序列（修复模版）。这段同源序列中应该携带需要替换的碱基，并伴随着同源重组的发生替换、并连接 CRISPR-Cas 系统造成的 DBS。通过将同源序列拼进基因组，达到碱基编辑的目的。
如果编辑位点离修复模版远端的距离大于 30 碱基，HDR 机制的编辑效率将会显著下降，且由于 PAM 的限制，比起 NHEJ 来说，HDR 机制下的 gRNA 的选择范围则窄的多。
gRNA 设计工具
除了编辑效率和脱靶效果的考虑，作为心细的科学家，我们还要考虑这些 gRNA 的制备是否容易，毕竟 RNA 造价不菲。所以在设计过程中还要尽力避免多聚核苷酸序列，诸如多聚胸腺嘧啶（Poly(T)）的序列，能有效终止 RNA 的转录，使得 gRNA 难以生产。
为了帮助科学家设计 gRNA，学术界已经开发了超过 30 种基于网页的 gRNA 设计工具。
Nature Method编辑着重介绍了由来自哈佛大学与 MIT 联合成立的博德研究所学者 John G. Doench 于 2020 年 4 月 13 日发表在Nature Biotechnology的综述文章 [2]，题为 Design and analysis of CRISPR–Cas experiments。
在这篇综述中，John G. Doench从市面上常见的 gRNA 设计工具总结出了 2 大 gRNA 设计规律组合，并建立了 gRNA 准确性的定量模型。Doench 团队的 gRNA 数据库现在可以在 Addgene 网站上找到。
而来自微软研究院的 Jennifer Listgarten（先任职于加州大学伯克利分校）与 Nicolò Fusi 在 Doench 的帮助下，分别设计了 gRNA 的 on-target 模型Azimuth与 off-target 模型Elevation。
CRISPick
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这两个基于人类全编码区的模型现在已经整合为CRISPick 工具，并在博德研究所的网站中可用。该工具是评估 gRNA 潜在脱靶效应与编辑效率的利器，也可以用于基于 CRISPR 系统的基因抑制与激活的评估，
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与此同时，Doench 也建立了一种名为 CFD （cutting frequency determination) 的评分规则，用以评估 gRNA 与特定 DNA 相互作用下的脱靶潜力。这个名为GUIDES的工具现在也可以线上使用。
目前GUIDES能够提供 spCas9 系统在人与小鼠中的评估，而CRISPick能够评估 SpCas9, SaCas9, AsCas12a 与 enCas12a 在人、小鼠与大鼠中的应用。
除此之外，诸如GPP sgRNA Designer, CHOPCHOP, CRISPOR, inDelphi等工具，也能用于预测 gRNA 活性以及编辑结果。
除此之外，尽管应用更少，起步更晚。一些用于碱基编辑（Base Editing）与刘如谦教授的引导编辑（Prime Editing）的 gRNA 设计工具也开始涌现。
在类似博德研究所所提供的免费工具之外，一系列实验耗材巨头也先后推出的 gRNA 设计服务。
安捷伦提供了免费 gRNA 设计工具，且能够在合成 gRNA 进行特定的修饰。IDT也提供了类似的工具，且适用于人以及包括小鼠、大鼠、斑马鱼与线虫在内的常见模式动物。
CRISPR 的出现，彻底改变了很多生物学家做实验的方法。是包括 Doench 在内的各位科学家的无私奉献，让 CRISPR 成为人人触手可及的神器。
如何设计 gRNA，你学会了吗？
参考文献：
1. Marx, V., Guide RNAs: it’s good to be choosy. Nature Methods, 2020.
2. Hanna, R.E. and J.G. Doench, Design and analysis of CRISPR–Cas experiments. Nature Biotechnology, 2020. 38(7): p. 813-823.
3. https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing