撰文 | 北野武花肉
责编 | 兮
人体各系统处于力学环境之中。伴随机体器官的发育和衰老，其生理活动和病理过程均受力学因素影响。力学环境的改变作用于组织细胞不仅产生形变和运动效应，更可导致复杂的生理以及病理生理功能的改变【1】。将力学原理和方法应用于生物医学研究，了解生命规律是生物力学(Biomechanics)的前沿热点，同时为医学研究和临床决策提供新的思路和方案。
在过去几十年里，肿瘤生物学家陆续揭示肿瘤的生物学特征，其中包括维持增殖信号，规避生长抑制，激活侵袭和转移，获能无限复制，诱导血管新生，以及抵抗细胞死亡，为人类研究和攻克肿瘤描绘了清晰的蓝图【2】。肿瘤进展过程中，肿瘤微环境扮演了重要角色并且贯穿始终【3】。肿瘤微环境的病理改变，包括炎性渗出，细胞浸润及收缩，细胞外基质重构促进肿瘤进展，同时也改变了肿瘤的力学特征【4-6】，其中成纤维细胞的收缩和外基质的硬化是改变肿瘤微环境力学特征的重要因素之一【1,5,7】。了解肿瘤微环境的力学特征改变是如何影响肿瘤生物学特征，厘清其中细胞机械力学相关的信号通路是亟待补完的一页。
纤维化是肿瘤组织显著特征之一，表现为间质细胞增多，主要是成纤维细胞激活并增殖，分泌并参与细胞外基质硬化；细胞外基质沉积增多，包括胶原纤维以及透明质酸【1,8】。肿瘤组织中的细胞成分和外基质成分并非均匀分布，肿瘤微环境表现出一定的空间上的异质性；近期研究表明肿瘤微环境的力学特征在亚细胞尺度上也远非均匀【1,9-11】。此外，在肿瘤内，肿瘤生物学特征也表现出空间上的异质性，例如肿瘤血管化程度在空间分布呈现出明显差异，进而可能导致空间上血流灌注差异【11,12】。因此，获取肿瘤不同区域力学特征信息，把肿瘤细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，内皮细胞以及细胞外基质的空间信息纳入肿瘤生物力学研究，将有助于更全面了解肿瘤生物学特征。
2020年11月20日, 来自德国海德堡大学、欧洲分子生物学实验室(EMBL) 的研究人员在Star Protocol以Protocol的形式发表了题为“Protocol on Tissue Preparation and Measurement of Tumor Stiffness in Primary and Metastatic Colorectal Cancer Samples with an Atomic Force Microscope”的文章，分享了将原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)应用于肿瘤组织研究的方法。
该课题组研究人员应用该技术，于2020年6月8日,在Cancer Cell以Article的形式发表的题为“Reduction of Liver Metastasis Stiffness Improves Response to Bevacizumab in Metastatic Colorectal Cancer”的文章。该研究首次揭示组织硬度在抗血管治疗抵抗中的作用（详见BioArt报道：Cancer Cell | 申颖/王晓虹等解析生物力学信号介导肿瘤抗血管生成治疗抵抗新机制）。
除了原子力显微镜，其他流变学测量(Rheological Measurements)技术，包括磁性扭曲仪(Magnetic Twisting Cytometry，MTC)，颗粒跟踪微流变技术(Particle Tracking Microrheology，PTM)，平行板流变仪(Parallel Plate Rheometry，PPR)，细胞单层流变技术(Cell Monolayer Rheology，CMR)，光拉伸技术(Optical Stretching，OS)；所依据的物理模型均基于相应的假设：原子力显微镜的原子力普模式(Atomic Force Spectroscopy, AFS)是基于一个假设：应力和应变之间符合线性关系，除去应力后物体恢复原状。而其他流变学测量技术则基于粘弹性行为：弹性模量是时间的函数，表现出随时间变化的行为（例如，潜变和应力松弛）【13】。另一个常见的假设：在测量过程中，物体的Poisson系数近似0.5，至少是一个常数。然而近期研究表明生物材料，小到亚细胞结构（例如，细胞质），大到组织器官表现出类似多孔弹性材料的力学特征。因此，在不同空间和时间尺度下，生物材料的Poisson系数并非常量，会不同程度地影响测量结果。
由于原子力显微镜技术，在肿瘤组织以及肿瘤微环境的空间和时间尺度下，能较好地满足其依赖的物理假设的情况下进行测量，因此作者选择原子力显微镜技术。在原子力普模式下，扫描探针相当于力学感受器，能够获取生物材料的力学特征信息，并同时将成像信息和力学特征信息在空间上联系起来。机械应力（压力，张力和剪切力）作用于物体产生应变（压缩，延伸和错动），生物材料的硬度被定义为抵抗机械应力引起应变的能力。硬度是机械性能而非物理常量，除了生物材料的物理常量（例如，弹性模量），还受材料的内部构造(Architecture)和几何构型(Geometry)影响。在AFS模式下，原子力显微镜记录了压力作用下生物材料的压缩应变，并生成力压痕曲线(Force-Indentation Curve)；而后通过接触力学模型（常用Hertz模型）拟合曲线【14】，再根据探针几何构型对曲线进行修正（Sneddon模型或Pyramidal模型）【15】。在这些模型下，只有弹性模量被获取（通常Young‘s模量）。所以通常用Young‘s模量来表示AFM获取的生物材料硬度。一般情况下，物体模量是相互耦合的（例如，弹性模量和剪切模量）；然而值得注意的是：实验观察到当对胶原纤维网【16】和器官组织【17】宏观测量时，即使仅发生百分级的应变情况下，其弹性模量和剪切模量不再相互耦合；提示测量结果转换成材料机械属性时可能发生错误。因此，各个流变学测量技术结果不能简单相关。
F: 压力；E: Young‘s模量；: Poisson系数；: 缩进距离；R: 球半径；: 探针夹角
原子力显微镜不需要对样本进行特殊的预处理，并且可以在不同条件（真空，空气和各种液体）下运行，因而力学信息可以在更接近于生物样本的在体(in vivo)条件下获取。基于这些优势，作者尝试用原子力显微镜获取原位瘤和转移瘤肿瘤血管化区域周围的力学信息。
实验可分为三步：第一步，样本制备；第二步，悬臂梁组装；第三步，原子力普测量。
Part 01
第一步，样本制备
作者提供了两种组织样本制备的方法：冰冻组织切片和新鲜组织切片。
冰冻组织切片的优势在于：一，能充分利用医院冰冻样本库以及潜在的快速病检价值；二，切片平整且厚度易于控制；三，制备快速且贴片牢固。缺陷在于：一，冰冻-解冻过程可能破坏生物组织的力学特征；二，长期低温保存可能影响其力学特征。作者尝试测量并对比组织切片快速冰冻-快速解冻前后的硬度，结果显示快速冰冻-快速解冻不会对原位瘤和肝转移瘤之间硬度差异造成影响。快速冰冻-快速解冻能较好地保存肿瘤组织硬度信息。
新鲜组织切片的优势在于避免了冰冻-解冻过程以及长期低温保存对生物样本力学特征的影响。缺陷在于包埋切片过程相对耗时，厚度不易控制，贴片较慢易松脱。
Part 02
第二步，悬臂梁组装
悬臂梁组装有两个难点：一，为了确保在生物样本的硬度范围内悬臂梁有足够的灵敏度，悬臂梁应选择合适的硬度。合适的悬臂梁的激光位移应落在光电探测器线性范围以内。二，Hertz模型时，压头为一个刚性小球，压头需粘连于悬臂梁正下方正中间。
Part 03
第三步，原子力普测量
生物材料的属于粘弹性材料。正如前文所述，原子力显微镜基于线性弹性假设，为了尽可能减少粘弹性应变影响，并获得较快的弹性模量测量速度，探针的缩进速度应依据生物样本不同而优化。简而言之，测量整个速度范围并确定一个具有恒定Young‘s模量的最大速度。作者发现对于结直肠癌样本，0.4 m/s是理想速度。更多采样点能够提供更高的空间解析度，但需要更长的时间。作者推荐在20x20m2采样区域内用5x5网格进行采样，并尽可能多的采集不同区域。
蛋白酶抑制剂被添加于实验所用液体，用以阻断组织中蛋白酶的酶解作用。实验结果显示含EDTA的蛋白酶抑制剂足以改变组织的硬度。作者建议使用不含EDTA的蛋白酶抑制剂。0.2% Triton X100溶解于磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS) ，实验结果显示0.2% Triton X100-DPBS溶液不足以改变组织的硬度。如需要预先标记组织，可用于穿孔染色。
本文的第一作者为德国海德堡大学的申颖博士，通讯作者为欧洲分子生物学实验室Alba Diz-Munoz博士和德国海德堡大学外科医院的Thomas Schmidt博士。本文为Cancer Cell推荐由Star Protocol邀请投稿。谨以此文，对美国国家科学院、国家工程院和国家医学院院士，中国科学院外籍院士冯元帧(Yuan-Cheng Fung)先生和美国国家科学院、国家工程院、国家医学院和国家艺术与科学院院士、中国科学院外籍院士钱煦(Shu Chien)先生在生物力学及心血管生物力学方面做出的开创性的贡献表达钦佩和敬意，对天津医科大学王晓虹博士以及圣地亚哥加州大学葉依婷博士的帮助致以感谢。
https://starprotocols.hivebench.com/protocols/409
1.Kai, F., H. Laklai, and V.M. Weaver, Force Matters: Biomechanical Regulation of Cell Invasion and Migration in Disease.Trends Cell Biol,2016. 26(7): p. 486-497.
2.Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Hallmarks of cancer: the next generation.Cell, 2011. 144(5): p. 646-74.
3.Quail, D.F. and J.A. Joyce, Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.Nat Med, 2013. 19(11): p. 1423-37.
5.Lampi, M.C. and C.A. Reinhart-King, Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease: From molecular mechanisms to clinical trials.Sci Transl Med, 2018. 10(422).
6.Northcott, J.M., et al., Feeling Stress: The Mechanics of Cancer Progression and Aggression.Front Cell Dev Biol, 2018. 6: p. 17.