3D生物打印是一种很有前途的新的组织修复技术，它可以精确地沉积细胞和生长因子，以便更接近地模拟天然器官的结构和功能。
在这项研究中，研究团队报道了一种新的生物墨水的开发，使用低聚富马酸乙二醇酯(OPF)，这是一种可光交联和可生物降解的聚合物，用于3D生物打印。除了OPF，还在生物墨水中加入了一小部分明胶，使其可生物打印。
在细胞培养液中浸泡后，明胶被洗脱出来，形成纯OPF的生物打印支架。以骨细胞和神经细胞为例，观察到包裹细胞具有良好的细胞活性、铺展能力和长期增殖能力。这些结果表明，OPF生物墨水在未来旨在复制复杂的、分层的组织和/或器官的3D生物打印应用中具有巨大的潜力。
生物材料的3D打印，通常称为3D生物打印，通过将工程技术和生物学原理结合到一个系统中，为未来的组织和器官修复提供了一种很有前途的替代品。3D生物打印的最大优势是它允许生物材料、细胞、生长因子和其他生物活性线索精确地沉积在三维空间中，使得能够紧密复制在自然组织中常见的复杂结构。由于这一优势，3D生物打印受到了包括生物医学工程、组织工程在内的许多领域的广泛关注。近年来，3D生物打印在仪器、生物油墨、交联方法和打印模型等方面得到了快速发展。
在这项研究中，研究团队报告了一种基于OPF的组织工程生物墨水的开发(图1A)。这种生物墨水由一种可交联的OPF聚合物和一小部分明胶组成。在生物打印之前，细胞首先被包裹在灭菌的OPF/明胶溶液中，产生细胞/墨水浆液。
然后，利用生物墨水中形成的明胶链的溶胶-凝胶转变，快速冷却这种浆料，获得粘性生物墨水凝胶(图1B)。然后，用气体辅助挤压生物打印机打印生物墨水，形成所需的形状，通过紫外光照射诱导聚合物交联，形成稳定的水凝胶，细胞被包裹在其中(图1C)。最后用预热的细胞培养液清洗生物打印的支架，以溶解和洗脱明胶部分(图1C)。
以氘代氯仿(CDCl3)为溶剂，成功地合成了OPF，其结构经1H核磁共振(NMR)确证(图2A-b)。为了确定打印支架的生物可印性和细胞存活率，通过离心法收集MC3T3前成骨细胞，并与OPF/明胶悬浮液(1×106个/mL)混合制成生物墨水，如图3A所示。然后使用CelLink Bio-X打印机设置打印生物墨水，然后UV交联2分钟。
为了使生物墨水在组织工程应用中发挥作用，生物墨水配方的交联性、凝胶化能力和可打印性必须进行优化，以满足3D打印和体内植入的挑战。为了筛选出最好的生物墨水，研究团队制备了一系列具有不同OPF浓度和明胶百分比的墨水。
除了交联能力，生物墨水的凝胶化能力也是至关重要的。OPF/明胶中的明胶起源于明胶聚合链之间形成的卷曲。研究同时考察了生物油墨的印刷性能。结果表明，适印性与凝胶性密切相关。对于明胶含量低于3%的油墨，凝胶化不成功，油墨类似于自由流体，印刷性能较差。对于明胶含量超过3%的油墨，通过调整印刷参数，油墨会发生胶凝，并能够印刷成不同的形状(图3e)。
基于上述生物墨水筛选结果，细胞介质中含有15wt%OPF和5wt%明胶的生物墨水具有良好的交联性、胶凝性、印刷性和较高的细胞密度，因此被选择用于支架的生物打印。通过调整打印参数，可以获得各种填充密度，图4A中显示了示例照片。在显微镜下观察生物打印支架的形状完整性和连续性，以及细胞分布情况。如图4B所示，支架呈均匀的脊状和横截面。细胞也均匀分布在支架上，如这些支架的放大图所示(图4C)。
为了评价生物油墨的性能，将清洗前后的交联OPF油墨制成圆形圆盘进行凝胶性能评价。冷冻干燥后，用扫描电子显微镜观察水凝胶的微观结构。如图5a-b所示，与清洗前的凝胶相比，清洗后的凝胶在水凝胶中显示出多孔结构。这表明明胶可以被洗掉，并在凝胶中留下微孔结构。为了评估交联型OPF生物墨水凝胶是否产生对周围细胞有细胞毒性的副产物，将水凝胶放入跨孔中，与MC3T3细胞共培养1、3和7d。如图5C所示，生物墨水与细胞共培养后没有明显的细胞毒性。
培养1、4、7d后，观察MC3T3前成骨细胞在生物打印支架中的细胞活力和密度。如图6A中的共聚焦成像所观察到的，生物打印的细胞均匀地分布在生物打印的支架内，培养1天后呈圆形。4天后，观察到细胞在生物支架的边缘开始生长，这可能是因为这些位置的细胞暴露在丰富的氧气和营养环境中(图6B)。培养7天后，在生物支架边缘和生物支架内观察到细胞生长(图6C)。
进一步对典型细胞形态进行了具体分析。在第1天，细胞主要呈圆形，丝状突起有限，如图6D所示。然而，经过4天的培养后，生物打印支架中的细胞显示出细长的形状，并有丝状突起(图6E)。典型细胞的放大图显示出清晰的细丝生长，如示意图所示。培养7天后，观察到大量的细胞群，细胞之间直接接触，表明被包裹的细胞之间实现了细胞间的相互作用(图6F)。
这些结果表明，生物打印支架可以允许营养物质渗透，并支持支架内良好的细胞生长。MC3T3前成骨细胞在支架中大部分存活，如图6g所示。增殖实验显示细胞在培养7天后显著生长(图6h)。这一观察结果与其他关于活组织印片后1周培养过程中细胞增殖的报道是一致的。
除前成骨细胞外，还观察了PC12神经细胞的活性和生长情况。如图7A所示，PC12细胞在生物打印支架中培养1、4和7天后显示出良好的活性。与MC3T3前成骨细胞相似，PC12细胞在培养第1天也呈现圆形形态(图7a-b)，表明OPF生物墨水也与PC12神经细胞具有生物相容性。培养4天和7天后，共聚焦成像观察到增殖的细胞群(图7C-F)。
综上所述，研究团队开发了一种“微结构”水凝胶生物墨水，该墨水具有网孔结构，旨在提高氧气和营养物质流向被包裹的细胞的能力。以可交联、可生物降解的OPF聚合物为聚合物骨架，以明胶为致孔剂，制备了一系列不同组成的生物油墨，并对其交联性、凝胶性和印刷性能进行了评价。生物打印后，用细胞培养液清洗支架，以从交联网络中去除明胶，并在材料内产生空隙体积。
由15wt%的OPF和5wt%的明胶组成的OPF生物墨水配方显示出优异的印刷性、凝胶性和交联性，并被选择用于MC3T3前成骨细胞的评估。活/死细胞染色显示，生物打印后的细胞具有良好的活性，而生物打印后的支架在培养基中培养一周后细胞增殖良好。
除了前成骨细胞外，PC12神经细胞也进行了生物打印，并在支架内显示出良好的细胞增殖能力。这些结果表明，OPF生物墨水是未来针对组织和器官工程的3D生物打印系统的一种有前途的选择。