目前，医学界已经测试了包含同种异体细胞的多层皮肤替代品用于治疗不愈的皮肤溃疡。然而，这种非天然皮肤移植物不能永久移植，因为它们缺乏对于与宿主组织整合重要的真皮血管网络。
在这里，研究团队描述了使用3D生物打印技术制造可植入多层血管化生物工程皮肤移植物的过程。移植物是使用一种生物墨水形成的，该墨水包含人包皮真皮成纤维细胞（FBs），源自脐带血人内皮集落形成细胞（HECFC）的人内皮细胞（EC）和悬浮在大鼠尾巴I型胶原中的人胎盘周细胞（PC），形成真皮，然后用包含人包皮角质形成细胞（KC）的第二种生物墨水进行印刷，形成表皮。在体外，KC复制并成熟以形成多层屏障，而EC和PC自组装成相互连接的微血管网络。真皮生物墨水中的PC与EC内衬的血管结构相关联，似乎可以改善KC成熟。
当将这些3D打印的移植物植入免疫缺陷小鼠的背部时，人类EC内衬结构会与伤口床产生的小鼠微血管相结合，并在植入后4周内被灌注。印刷的真皮中PC的存在增强了宿主微血管对移植物的侵袭，并增强了表皮网状组织的形成。
3D打印可用于生成多层血管化的人体皮肤移植物，这些移植物可以潜在地克服当前无血管皮肤替代物中观察到的移植物存活的局限性。真皮生物墨水中包含人PC似乎可以改善真皮和表皮的成熟度。
糖尿病或压力引起的皮肤溃疡是全世界医学界的难题，并且随着预期寿命的增加和糖尿病的患病率的增加，这种疾病将增加，容易患病的患者通常伤口愈合不良，无法愈合的皮肤伤口可能直接导致残疾，并发展为局部和全身感染并发症。目前的治疗包括局部伤口疗法：敷料和植皮。自体皮肤移植虽然有效，但在收获部位会产生新的伤口，这些伤口的愈合也很差，同种异体皮肤可以闭合伤口，但会触发患者的免疫系统强烈排斥。
组织工程化的多层皮肤移植物是第三种治疗选择。在本文中，Tnia Baltazar团队展示了使用人细胞和3D打印技术制造的多层血管化皮肤构造的制造工艺，该技术在植入免疫缺陷小鼠后通过移植物和宿主微血管进行灌注。
图1.培养的人类皮肤FB，胎盘PC和ECFC衍生的EC的免疫表征和表型。
（A）皮肤FBs表达β-平滑肌肌动蛋白，PDGFR-γ，PDGFR-γ和CD90，但不表达NG2，这已通过免疫荧光显微镜证实。胎盘PCs的α-平滑肌肌动蛋白，PDGFR-α，NG2和CD90染色呈阳性，但PDGFR-β呈阳性。
（B）对皮肤FB的流式细胞术分析证实了PDGFR-1，PDGFR-1和CD90的表达。此外，这些细胞缺乏NG2，CD31和CD45的表达。如通过流式细胞术所证实的，PC显示PDGFR-1，NG2和CD90的阳性表达，但是缺乏PDGFR-1，CD31和CD45的表达。
（C）人ECFC衍生的ECs通过免疫荧光显微镜染色为VE-钙粘蛋白阳性，并通过流式细胞术分析显示CD31阳性表达，但CD45阳性。流式细胞仪的特异性染色显示为绿色；同种型匹配的对照染色显示为红色。在来自不同供体的3次独立分离中观察到相似的结果。比例尺：100 m。
生物印刷皮肤移植物不同表皮/真皮隔室的生成和表征：
为了能够打印多层3D皮肤结构，研究团队以前使用NaHCO3雾化来交联胶原蛋白，在该模型中，依次沉积了8层胶原蛋白前体。在胶原蛋白和成纤维细胞的每一层之间，将雾化的NaHCO3用作交联剂。
团队测试了这种凝胶化方法，以制造由人原代细胞组成的血管化皮肤移植物，并将雾化时间从5秒更改为10秒。然而，雾化不能促进成纤维细胞在真皮内的均匀分布并不能支持角质形成细胞的分化（图2A）。
图2.体外生物打印的皮肤构造的真皮/表皮区室的优化，成熟和表征。
（A）评估雾化的NaHCO3作为胶原交联剂对3D生物打印结构中真皮FB分布和KC分化的影响。顶部图像显示为在第3天打印的构建体的z叠层落射荧光图像的最大投影。分别用CellTrackerTM Red CMPTX和CellTrackerTM Green CMFDA染料对FB和KC进行荧光标记。下图显示了打印后20天的生物打印结构的H＆E染色，表明雾化胶原蛋白层时FBs的分布不均。比例尺：100 m。
（B）示意图，显示了人类皮肤等效物的逐层生物打印。
（C）体外成熟30天后，人类包皮和生物印记的构建体的H＆E和免疫荧光染色的代表性图像。印刷的移植物显示出与人包皮相似的丝聚蛋白，细胞角蛋白14，细胞角蛋白10和IV型胶原蛋白的阳性表达。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：100 m。
研究团队开发了一种胶原交联的替代方法，即将印刷前将细胞与pH重建缓冲液混合，然后在37C的皮肤分化培养基中孵育（图2B）。从第4天开始，在空气-液体界面（ALI）上培养印刷的皮肤构建体。在第30天，这些生物印刷的构建体显示出真皮中成纤维细胞分布的显着改善，以及随后印刷的表皮区室的形态得到改善，所得的上皮具有组织良好的立方基底细胞粘附在基底膜上，表明成熟皮肤组织的发育。
研究团队评估了将HECFC衍生的EC整合到生物打印的皮肤移植物的真皮隔室中时产生血管状结构的能力。我们首先评估了皮肤分化培养基在体外诱导和/或维持内皮网络的能力（图3A），重要的是，在随后的皮肤分化培养基中培养多达50天，没有观察到血管退化的迹象。
图3.评估培养条件以允许内皮细胞在体外生物打印的真皮构建物中组装。
（A）测试的培养条件的时间表：在皮肤培养基中培养4天的生物打印的真皮结构中，与真皮FB共培养表达RFP的EC（协议A）；或EGM2持续4天，然后在皮肤培养基中培养至体外培养的第37天（方案B）。
（B）用协议A培养的生物打印的皮肤构建体的活细胞荧光显微镜检查，表明不存在EC网络的形成，而协议B促进了EC网络的自组装和长期维护。比例尺：100μm。
（C）在第10天在皮肤培养基中体外自组装内皮网络的3D重建。比例尺：50μm。网格定义3D空间。
（D）对印刷的样品进行50天的随访，以评估长期内皮网络在皮肤培养基中的稳定性和生存能力。活细胞用钙黄绿素（绿色）染色，细胞核用Hoechst（蓝色）染色。
（E）打印后7天，对表达RFP的EC，Cy5-真皮FB和表达GFP的PC的共培养物进行实时成像。比例尺：100μm。
为了产生用于植入的血管化双层皮肤构造，将皮肤和表皮隔室分为两个阶段进行印刷。首先，用人的EC和FB对经过血管处理的真皮隔室进行生物打印，并在EGM2中培养4天，以促进血管的自组装。第二，在第4天对包含KCs的表皮隔室进行生物打印，并在皮肤分化培养基中培养直至植入，而不暴露于ALI（图4A）。
图4.植入前3D生物打印的血管化皮肤等效物的表征。
（A）制造人血管化皮肤等效物的两阶段协议时间表。首先，对在EGM2中培养了4天的带血管真皮隔室进行生物打印，其次，对表皮隔室进行生物打印并在皮肤培养基中进行培养。在第8天，将生物印刷的构建体表征或植入免疫缺陷小鼠模型中。
（B）人体植入时H＆E和免疫荧光染色对成人皮肤和生物打印结构的代表性图像。含有EC的生物打印的皮肤移植物显示出人类CD31 +血管样结构，而没有人EC的生物打印的移植物则没有。生物打印的皮肤移植物在表皮基底层中显示Ki67和CK14阳性表达。含有人PC的皮肤移植物显示层粘连蛋白5和CK10 +基底上终末分化的KCs表达增加。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：50 m。
在体外培养8天后，将带有或不带有人类EC和PC的生物打印的皮肤移植物植入免疫缺陷小鼠的背部（图5A）。在一项先导实验中，植入了14天的生物打印的皮肤移植物显示出高度的出血和炎症，尤其是在与包含人血管细胞的移植物相比的非血管化生物打印的移植物中（图5B）。
图5.在免疫缺陷小鼠上植入时和植入后2周的3D生物打印的皮肤移植物的表征。
（A）植入时有或没有合并EC和PC的生物打印移植物的照片。
（B）植入后2周，H＆E和生物打印结构的免疫荧光染色的代表性图像。与包含EC的移植物相比，H＆E染色显示非血管化生物打印皮肤移植物的出血程度更高。UEA-1染色显示存在人类EC衬里的血管。特别是在含PC的血管化生物打印移植物中观察到网纹的形成。比例尺：50 m。
植入后第30天，通过整合素染色评估了表皮的人类起源，整合素染色是人类KC终末分化的标志（图6A）免疫组织化学分析证实，生物印刷的血管化皮肤移植物的表皮是由人KC形成的。而且，在没有EC的生物打印的移植物中观察到明显的收缩。在第30天对生物打印的移植物的组织学分析证实，与移植的血管化皮肤相比，没有EC的生物打印的移植物明显更小，并且小鼠皮肤所占据的面积明显更大。
图6.植入后4周的3D生物打印的皮肤等效物的表征。
（A）在伤口边缘对人整合素的免疫组织化学染色，显示3D生物打印的血管化皮肤的表皮是人类起源的。比例尺：50 m。
（B）代表性的H＆E图像的生物打印的移植物显示收缩的程度。没有EC和PC的生物打印的移植物明显较小，小鼠皮肤占据的面积更大。生物打印的移植物和小鼠皮肤之间的边界通过表皮薄，毛囊的存在和具有脂肪组织的真皮深层来确定。比例尺：1毫米。
（C）在植入后4周，用人EC配制的替代物包含血管结构。通过用GSL-B4染色来评估小鼠微血管的存在和小鼠巨噬细胞的浸润。和F4 / 80抗体。为了证明灌注了人类EC衬里的血管，在移植前30分钟注入了荧光UEA-1。箭头指向灌注的人类衬里血管。血管化生物打印的移植物显示出网纹状结构的形成，特别是在含有PC的生物打印的移植物中。比例尺：100 m。
皮肤的多层分层结构使其成为使用3D生物打印法制作的原型组织。在这里，研究团队证明了3D生物打印技术可用于从形态和生物学上与人类皮肤相似的人类细胞体外制备血管化的人类皮肤。
研究团队证明了使用源自HECFC的EC和胎盘PC来生成可植入的皮肤移植物的潜力，该移植物包括使用3D打印的可灌注微血管系统。