直接注射细胞水凝胶在转化性治疗中显示出很高的组织再生潜力。传统的细胞水凝胶在注射后经常被用作组织缺损的体积填充物，这可能限制了其结构的可控性。另一方面，图案化的细胞载水凝胶结构常常需要侵入性的外科手术。
为了克服这些问题，这里报道了一种独特的策略，将活的人类细胞包裹在基于造孔明胶甲基丙烯酰基(GelMA)的生物墨水中，最终通过3D挤压生物打印产生可注射的分级宏微纳米多孔GelMA水凝胶结构。
这种水凝胶结构可以根据缺陷制造成各种形状和大小。由于宏观-微观-纳米孔的层次化结构，载细胞水凝胶结构可以很容易地恢复到原来的形状，并在压缩和注射后保持较高的细胞存活率、增殖、铺展和分化。此外，体内研究进一步表明，这种水凝胶结构可以与周围的宿主组织很好地结合在一起，独特的3D生物打印形成孔的GelMA水凝胶结构在微创组织再生和细胞治疗方面有很好的应用前景。
微创注射能够将生物材料植入受伤组织的缺损处，用于伤口修复和组织再生，克服了临床植入的局限性，因为临床植入不仅具有感染或炎症的高风险，需要训练有素的临床医生进行复杂的外科手术。然而，直接将治疗性细胞注射到缺损处，其固位和植入效率较低。由于其高含水量和类似组织的机械性能，作为仿生活体组织的治疗细胞水凝胶被认为是一类用于通过经皮针或导管微创注射的良好载体。
为了确保细胞负载的水凝胶结构在注射后能够被正确地利用来修复受损的组织，聚合的水凝胶结构应该及时地适应缺损的形状。3D生物打印提供了一个通用的平台，可以以空间可控的方式精确地生产具有复杂结构的体积水凝胶结构。细胞载水凝胶因此可以密切地满足组织修复对各种可定制形状的需求。3D生物打印已被广泛用于设计具有各种定义形状的大纳米孔细胞载水凝胶，但产生的微纳米孔结构的细胞载水凝胶同时具有优异的注射性能。
在这里，Guoliang Ying团队报道了3D生物打印细胞分级宏微纳米孔水凝胶结构的独特潜力，这种水凝胶结构具有可定制的形状，可以通过传统的经皮针注射和成形，用于微创治疗。明胶甲基丙烯酰基(GelMA)具有按需光交联性、可调的物理化学性质和内在生物活性等优点，被用作水凝胶材料。
如下图图1示意，研究团队概述了可注射3D生物打印细胞负载水凝胶结构的制备过程，其特征是宏微纳米孔分层互连。
图1.使用双水相生物墨水制作3D生物打印的分层多孔水凝胶结构的示意图。A)含有预凝胶GelMA/cell和PEO共混物的双水相乳状生物油墨。B)3D生物打印和光交联。C)微创注射分级多孔水凝胶结构。D)3D生物打印的GelMA水凝胶的分级宏观-微观-纳米孔结构：i)大孔，ii)相互连接的微孔，以及iii)纳米孔。
将具有不同空间形状的三维生物打印水凝胶结构在荧光和明视场中显示出来。为了控制水凝胶结构的孔隙率，在双水相生物墨水中，PEO的体积分数从50%到10%变化。具有不同孔径的水凝胶结构如图2c所示。与罗丹明B结合的水凝胶网络发出红色荧光，而深色区域表示微孔(图2ci)。进一步冷冻干燥分级多孔水凝胶结构和标准水凝胶结构，并用扫描电子显微镜(SEM)对其进行表征，下图证实了可以通过调节PEO体积分数和混合时间来方便地调节孔隙率。
图2.三维生物可打印分级多孔水凝胶结构的特征。A)具有不同空间形状的3D生物打印水凝胶结构的照片。B)分层多孔水凝胶结构的3D重建。插图显示放大的相互连接的微孔结构。CI)荧光和II)PEO体积分数分别为10%、30%和50%的互联多孔水凝胶结构的扫描电子显微镜(SEM)照片。D)在10%、30%和50%的PEO体积分数下，水凝胶结构的平均孔径随PEO体积分数的变化而变化(n=3，*p<0.05)。不同PEO体积分数水凝胶的应力-应变曲线及可逆性试验(PEO=50vol%)
由于形状恢复是决定水凝胶构造物可注射性的关键因素，因此对形状记忆特性进行了进一步的研究。将水凝胶构件夹在两个玻璃压力垫之间，在1N的恒定机械载荷下，在室温下以60%的应变进行轴向压缩（如下图所示），应力消除后，水凝胶结构在松弛状态下迅速恢复到原来的形状，没有结构损伤，这与图2G所示的可逆性测试结果一致。即使经过50次压缩试验，其直径和孔径仍与原始松弛状态下的相近。因此，在评估的应变水平下，3D生物可打印微纳米孔水凝胶结构不受机械压缩的影响。
图3.三维生物可打印微纳孔水凝胶结构的形状记忆性能评估。A)压缩试验程序示意图。B)标准水凝胶结构在(松弛)压缩试验前、(压缩)期间和(松弛)压缩试验后的形态和微观结构。C)直径和d)多孔水凝胶结构的平均孔径变化，并进行50次压缩试验。(C)中的插图是照片，(D)中的插图是在1个周期(左)、25个周期(中)和50个周期(右)压缩后，水凝胶结构在松弛和压缩状态下的荧光显微照片。
检测了3D生物打印的分层多孔水凝胶结构在注射后流经常用规格的经皮针并随后恢复其原始形状完整性的能力。在流经皮针的过程中，由于受到剪切力和物理限制，水凝胶结构将受到与所施加的压力类似的体力，这可能会导致它们的坍塌。
图4.使用不同规格的经皮针在体外和体外对3D生物打印的分级宏微纳米孔水凝胶结构的注射性测试。具有不同程度的甲基丙烯酰基取代(低、中、高)的水凝胶结构的通过效率作为a)经皮针规和b)PEO体积分数的函数。3D生物打印的宏微纳米孔水凝胶的荧光显微照片构建了c)注射后使用不同的经皮针的量规以及d)在体外注射前后不同PEO体积分数的荧光显微图像。E)使用猪组织模型显示可注射性性能的照片。F)具有不同3D图案的形状记忆水凝胶构造物的照片：i)设计，ii)剪裁有不同图案的猪组织，iii)在相应的猪组织缺损内注射水凝胶构造物之后，以及iv)在相应的猪组织缺损内的水凝胶构造物的荧光图。
为了评估3D生物打印的微纳米孔水凝胶构造物是否能够保持可注射性和形状记忆特性以符合生物组织中的不规则缺陷，通过使用14G针将不同图案的微孔性水凝胶构造物注射到猪组织的缺损处进行了体外试验。再次采用挤压3D生物打印技术制备了尺寸和图案相匹配的微纳米孔水凝胶结构作为缺陷。注射器注射后，观察到具有不同图案的水凝胶结构迅速恢复到原始形状，与猪组织中的缺陷精确匹配(图4f)。结果证明了三维生物打印微纳米孔水凝胶在体外环境下的可注射性和形状记忆特性。
3D生物打印水凝胶结构中负载细胞的生理特性是体内注射实现组织修复所必需的。因此，研究团队研究了三维生物打印的层状多孔水凝胶结构在压缩和注射后的细胞活力、扩散、增殖和分化。人骨髓间充质干细胞(HMSCs)被归类为多能祖细胞，可以被定向分化为特定的谱系以促进不同组织的再生。
图5.加压和注射后hMSC在水凝胶结构中的活性和增殖的评估。A)荧光显微照片，b)活力，以及c)在压缩前后3D生物打印的多孔凝胶结构内的细胞增殖。活细胞呈绿色，死亡细胞呈红色。对照组为不加压、不注射的水凝胶构件组。D)在i)低倍和ii)高倍数下构建的多孔水凝胶内扩散的细胞的荧光显微照片。对细胞进行F-肌动蛋白(绿色)和细胞核(红色)染色。Iii)多孔水凝胶结构内扩散细胞的三维重建。(Iv)计算第1天、第3天和第7天的细胞铺展面积(n=3，*p<0.05)
综上所述，压缩和注射过程都不影响hMSCs在三维生物打印的分级多孔水凝胶结构中的存活、增殖和扩散，使它们有可能在细胞存在的情况下进行注射和输送。
为了研究压迫或注射对层状多孔水凝胶结构内hMSCs分化能力的影响，对包裹的hMSCs进行成脂和成骨分化，并进行相关染色（图6），结果表明，与同类产品相比，所生产的层状多孔水凝胶结构促进了成骨。此外，受压迫或注射的hMSCs表现出与对照样本相似的行为。综上所述，在三维生物印迹的微纳米孔水凝胶构建物中，hMSCs保持和促进成脂和成骨分化潜能可能是因为聚合物网络中的微孔为细胞的增殖、迁移提供了足够的空间。
图6.三维生物印迹的多孔水凝胶构建物内hMSC分化的评估。I)照片和ii)定量的油红O染色的hMSCs包裹在3D生物打印的多孔凝胶构建物在不同的处理下在成脂3周。I)荧光显微照片；ii)在3周的成脂过程中，对包裹在3D生物印迹的多孔水凝胶结构中的人骨髓间充质干细胞进行PPARγ免疫染色的半定量测量。I)照片和ii)定量的茜素红S染色的hMSCs被包裹在3D生物打印的多孔凝胶结构中，在成骨后的3周，在不同的处理下。3)成骨后3周，扫描电子显微镜下可见分化的细胞(蓝色假色)和微纳米孔水凝胶中的矿物质沉积。(I)荧光显微照片和(Ii)RUNX2免疫染色半定量测定包裹在三维生物印迹的多孔水凝胶构建物中的hMSCs在3周的成骨过程中的RUNX2免疫染色(n=3，*p<0.05)。
为了评估水凝胶构建物在再生过程中无移位风险的情况下被输送并完全整合到缺损区的能力，将标准水凝胶构建物和微纳米孔水凝胶构建物注射到Sprague-Dawley大鼠皮下，并对其进行了评估。
图7.3D生物打印水凝胶结构的体内研究。A)大鼠皮下注射的照片。B)Masson‘s三色染色和c)H&E染色：1)标准的GelMA水凝胶，2)植入后1周和2周的多孔GelMA水凝胶。D)组织内生率作为植入时间的函数。E)组织内水凝胶降解率随植入时间的变化。F)组织内残留的水凝胶面积随植入时间的变化(n=6)
综上所述，三维生物打印细胞层状多孔GelMA水凝胶结构已经被开发出来，并展示了其良好的性能。微孔不仅极大地改善了细胞载水凝胶结构的可压缩性和可注射性，而且允许hMSC增殖、迁移和分化。此外，具有形状记忆特性的可注射水凝胶结构是可生物降解的，可以促进组织在体内的生长。这种新型的可注射3D生物打印细胞多孔水凝胶是微创注射和伤口修复的一种很有前途的载体。
3D生物打印提供了一个多用途的平台，可以生产出符合缺陷的理想形状的水凝胶结构。除了可调节的机械性能外，这些水凝胶结构在体外、体外和体内都表现出优异的可注射性和形状记忆性能，这主要是由于水凝胶结构的相互连接的微纳米孔结构。
此外，生物学研究表明，水凝胶结构在压缩后和注射后仍保持其原有的结构和功能特征。可生物降解的GelMA水凝胶结构的一个关键特征是在生物组织愈合或再生之前提供暂时的结构完整性。虽然构造物的大小和形状应该保持不变，但这需要精确控制水凝胶构造物的生物降解率和机械性能。由于本研究中使用的GelMA水凝胶最初是从生物组织中提取的，它们在体内的降解速度相对较快。甲基丙烯酰基取代度的增加会部分降低降解速率。其他可能的延长降解时间的策略可以通过加入其他生物相容性成分来实现。
如果需要，可以通过加入生物无机材料(如羟基磷灰石)进一步获得更高的机械性能。由于我们的3D生物打印层次化的宏微纳米多孔细胞水凝胶构建物能够与体内的组织部位保持一致，因此各种类型的细胞都有可能被包裹在构建物中用于不同组织的再生，如神经元组织、骨组织、皮肤组织、和血管网络等。因此，这些独特的水凝胶结构被认为具有作为可注射植入物的显著潜力，这些植入物可以支持体内组织修复和再生治疗。