轴突再生是再生神经生物学的基本挑战之一，需使用特制生物材料来控制细胞和生物分子的传递。目前备受关注的构建方法是直接将工程蛋白组装成高级结构，而这一过程通常依赖复杂的蛋白质化学。此类蛋白质材料具有遗传编程和功能多样性，已成为天然或合成聚合物很有潜力的替代品。且金属-配体的配位相互作用在转录调控、蛋白质相变和水下黏附等生物现象中起着至关重要的作用。因此作者设想，His6-tag与过渡金属离子(Co、Ni、Cu和Zn)之间的配位相互作用，也可能为重组蛋白组装成高级结构提供一种通用方法。
基于此，香港科技大学孙飞课题组提出了一种简单有效的方法：通过金属定向组装His6标记的蛋白质来构建可注射的光响应水凝胶。B 12依赖的光受体蛋白CarH C可以通过氨基末端的His6-tag与过渡金属离子络合，在加入辅助因子AdoB 12后进一步进行溶胶-凝胶转变，从而形成具有明显可注射性和可光降解性的水凝胶。这种可诱导的相变使细胞和蛋白质易于包裹和释放。将修饰有白血病抑制因子LIF的Zn 2+配位凝胶注射到损伤的小鼠视神经中，可延长细胞信号转导时间，并促进轴突再生。本研究阐明了设计可注射生物材料的有效策略。该研究以题为“Injectable, photoresponsive hydrogels for delivering neuroprotective proteins enabled by metal-directed protein assembly”发表在最新一期《 Science Advances》上。文献DOI: 10.1126/sciadv.abc4824
蛋白质结构设计
作者选择了His6标记的模型系统重组蛋白（图1）：SpyTag-ELP-CarH C-ELP-SpyTag (ACA)，结构中心区域CarH C是B 12依赖的光感受器， 辅助因子AdoB 12中的C - Co键对绿光(522 nm)敏感。CarH C自组装成四聚体, 在黑暗中与AdoB 12结合并在光照下分解成单体，伴随着AdoB 12中光不稳定的C—Co键断裂，释放出4′，5′-脱水腺苷，His 132与Co中心配位。侧翼的ELP结构域由重复的五肽 (VPGXG) 15组成。
图1. His6标记CarHC的金属定向组装成光响应水凝胶
蛋白质组装及其可注射性
在AdoB 12存在下，His6-tag与二价过渡金属离子（如Co 2+、Ni 2+、Cu 2+、Zn 2+）能诱导ACA凝胶化(摩尔比ACA:M=1:2)。流变学测量结果(图2A)显示，暗箱中加入AdoB 12后，在15 min内达到稳定状态。对四种M 2+-配位凝胶进行扫频试验，证实了固体物质的形成(图2B)。将凝胶与Tris缓冲液在黑暗中浸泡5天后，蛋白损失小于10%，表明金属协调蛋白网络的显著稳定性(图2C)。同时，M 2+协调凝胶进行了快速gel-sol转型,伴随着G’的明显降低，在连续的白色发光二极管照明(图2D)。总之，以上结果证明了利用His6-tag/M 2+配位相互作用将His6-tag CarH C转化为稳定的光响应性水凝胶的可行性。随后，金属配合CarH C水凝胶的应变扫描试验结果显示了其强大的自愈行为，以及它们的急剧屈服转变，高度指示了可注射性，这表明其可能用于侵入性较小的治疗传递。
图2. 金属配位蛋白质网络的物理性质
细胞包封和光诱导释放
作者检测了Zn 2+封装小鼠细胞的能力。标准活/死染色法结果表明，经包封12 h后，大部分3T3成纤维细胞(90.0±3.6%)和骨髓间充质干细胞(88.0±1.4%)仍然存活(图3)，证实了Zn 2+配位凝胶的细胞相容性。在光照下，被包封的细胞在8 min内可以从Zn 2+凝胶中释放出来。金属配位光响应水凝胶因具有毒性低、易于细胞封装和回收的特点可能成为三维细胞培养和移植的多功能系统。接着，作者证明了利用金属配合光响应水凝胶进行光学控制递送蛋白质治疗及在体内实现延长生物信号传导的可行性。
图3. 光诱导细胞释放
富含LIF的水凝胶促进轴突再生
最后，利用视神经挤压模型进一步研究了富含LIF的水凝胶对神经保护和轴突再生的影响。C57BL/6小鼠视神经损伤后，玻璃体内注射在玻尿酸（TBS）、TBS中的LIF溶液或LIF凝胶。在黑暗和正常昼夜条件下，使用含LIF的凝胶可使活体RGC的数量增加约30%，表明凝胶在体内具有更好的神经保护作用。与TBS治疗的小鼠相比，注射LIF溶液或LIF载药凝胶可显著增强轴突再生，尤其是长度≥0.2 mm的轴突（图4）。注射LIF凝胶后，黑暗下饲养的小鼠表现出较强的轴突再生，其中再生轴突的数量（0.5 mm）是用LIF溶液处理的小鼠的3倍。综上所述，结果证明了金属配位的蛋白质水凝胶能够持续传递神经保护蛋白，展示了其在神经再生方面的潜力。
图4. 视神经轴突再生
研究结果
该研究报道了利用His 6标记CarH C金属定向组装的可注射的光响应蛋白水凝胶。由于其化学/光诱导的相变，这些蛋白质材料使得活细胞和生物活性蛋白质可以轻易地包封和可控释放。这种饰有神经保护细胞因子的凝胶已被证明在体内有效地增强神经细胞存活和促进轴突再生，从而为解决再生神经生物学面临的挑战指明了新方向。
全文链接：
https://advances.sciencemag.org/content/6/41/eabc4824
来源：高分子科学前沿
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