生物工程纤维软骨组织以恢复半月板功能的先进策略是必要的。目前，3D生物打印技术已被用于制造与临床相关的患者特定的复杂结构，以满足未满足的临床需求。
在本研究中，研究团队通过将载细胞结冷胶/纤维蛋白原(GG/FB)复合生物墨水和丝素蛋白甲基丙烯酸酯(SIL-MA)生物墨水交织成交叉线，制备了一种用于纤维软骨再生的高弹性杂化结构。通过测定生物墨水的流变性能、溶胀度和压缩力学性能，对每种生物墨水配方进行表征。为了进行体外生物学评价，分离猪原代半月板细胞(PMC)，并将其悬浮在GG/FB生物墨水中进行打印。
结果表明，GG/FB生物墨水具有良好的细胞微环境，可维持细胞的活力和增殖能力，促进生物印染构建物中基质细胞的成熟，而SIL-MA生物墨水具有良好的生物力学行为和结构完整性。
更重要的是，这个生物打印的杂交系统显示了在移植后10周的小鼠皮下植入模型中纤维软骨组织的形成，而没有尺寸变化。特别是，胶原纤维的排列是在生物印染的杂化结构中实现的。结果表明，这种生物印染的机械增强的混杂结构为生产先进的纤维软骨组织提供了一种通用的和有前途的替代方案。
纤维软骨主要见于膝关节的半月板、颞下颌关节和椎间盘纤维环。半月板是无血管的，导致固有的再生能力较差，损伤经常导致退行性疾病。由于半月板组织退变的患者数量增加，关节镜下半月板部分切除术是最常见的骨科手术之一。到目前为止，由于半月板独特的拉伸和压缩特性、变形能力和复杂的微结构，缺乏治疗选择。因此，迫切需要先进的生物工程策略来构建纤维软骨组织。
为了解决生物3D打印环节中，生物墨水在半月板修复手术中的循环压缩负荷，Joao B. Costa团队 开发了一种新型的3D杂交组织结构，通过依次将载细胞的结冷胶(GG)和含有猪半月板细胞(PMC)的FB复合生物墨水和丝质甲基丙烯酸酯(SIL-MA)生物墨水(图1B)共打印，用于纤维软骨组织的再生。
研究团队假设，载细胞的GG/FB生物墨水将提供细胞活动和组织形成所需的生物微环境，而SIL-MA生物墨水将提供3D打印过程所需的机械支持和稳定性，以及打印组织构建物的结构完整性和力学性能。我们通过测量细胞活性、增殖和体外成熟来检测生物打印的杂交组织结构，并使用小鼠皮下植入模型验证纤维软骨组织的形成、组织和尺寸维持。
图1.生物打印杂交组织结构的生物墨水配方示意图。(A)GG和FB复合生物墨水，通过离子交联和酶交联形成稳定的水凝胶结构。(B)通过与MA反应，用甲基丙烯酸酯基对SF进行化学改性，生成SIL-MA。
GG/FB复合生物墨水的制备与表征:对6种不同浓度的FB(1，2，3，4，5和6 mg/mL)与GG混合进行了流变学评价(表1)，并以GG单独作为对照。在不同频率和低应变下的振荡测量表明，所有GG/FB生物墨水配方之间没有显著差异(图S1)。GG/FB复合生物墨水主要表现为弹性行为(G‘>G“).。此外，所有生物墨水配方都表现出剪切变稀行为，这在基于挤压的生物印刷中是至关重要的(图2A)。
图2.GG/FB生物墨水的材料特性和体外生物学评价。(A)不同FB浓度的GG/FB生物油墨交联前的粘度和(B)交联后GG/FB水凝胶的压缩弹性模量。(C)仅在GG和GG/FB4载体中打印的PMC在培养1、3、7和14天显示活性的活/死染色图像，活细胞以绿色染色，死亡细胞以红色染色(比例尺：200μm)。(D)AlamarBlue实验证实印刷的PMC在GG和GG/FB4载体中的代谢活性在培养的第1、3、7和14天。在培养的第14天和28天，定量测定单独的GG和GG/FB4构建的(E)胶原和(F)GAG的产量。(G)培养28天(比例尺：50μm)后生物打印的GG和GG/FB4结构的非极化(左)和极化(右)印迹天狼星红染色图像。*p<0.5，**p<0.0 1，*p<0.001，差异有统计学意义。对照组为单纯GG组，不加FB组。
维软骨组织的特征是存在于承受巨大压缩和拉伸载荷的人体区域。尽管GG/FB4结构显示出更好的力学性能和结构完整性，但其力学性能和稳定性不能满足纤维软骨再生的要求。在此，研究团队开发了SIL-MA生物墨水，为生物工程纤维软骨组织构建提供更好的力学性能和结构完整性。制备了三种不同甲基丙烯酸酯化程度的Sil-MA基生物油墨。
图3.SIL-MA生物墨水的材料表征和体外生物学评价。(A)不同甲基丙烯酸酯度的SIL-MA生物油墨的粘度。(B)在孵化第0、1、7、14天时发生构象变化。(C)SIL-MA支架在培养0、1、7、14天的压缩弹性模量(*与SIL-MA(L)在0、7、14天比较P<0.05；*与SIL-MA(M)在1天时比较P<0.05，与其他各组比较**P<0.05)。(D)不同甲基丙烯酸酯度的SIL-MA结构的扫描电镜图像。(E)接种sIL-MA构建物的PMC在培养第1、3和7天的活/死染色图像，活细胞以绿色染色，死细胞以红色(比例尺：200μm)染色。(F)AlamarBlue实验证实，接种于SIL-MA载体中的PMCs在培养的第1、3和7天具有代谢活性(N.S.：不显著)。
在水溶液条件下测定了SIL-MA构象随时间的变化。这些构象可以通过从随机卷曲到晶体构象(β-Sheet)的自发构象变化来检测。在本研究中，通过紫外光曝光的光交联过程也证实了SIL-MA构象的自发构象变化。通过改变甲基丙烯酸酯度，结果表明有可能调节构象变化的速率，以及随着时间的推移机械性能的改善。这些结果表明，SIL-MA结构的压缩力学性能可以通过构象变化和交联度来调节。
图4.三维生物打印混合结构的压缩力学性能。(A)生物印染的SIL-MA(H)、GG/Fb4和混杂结构在孵育后0和14d的应力-应变曲线和压缩弹性模量(*与GG/Fb4比较，**N.S.：无显著性)。(C)三维生物打印的SIL-MA(H)和混合结构在压缩测试下的外观。生物印染(D)-SIL-MA(H)和(E)杂化结构的压缩循环应力弛豫曲线。
三维生物印刷杂合组织构筑物的体内纤维软骨再生。为验证生物印迹杂化构建物用于纤维软骨再生的可行性，将构建物植入裸鼠皮下，分别于植入后2、5、10周取材。宏观评估显示，在植入10周期间，杂合结构保持了其原始尺寸，并且在SIL-MA(H)和混合结构中观察到了血管化(图5A，B)。
图5.3D生物打印杂交构建物的体内生物学特性。(A)用于生产3D生物打印构件的打印图案方案以及植入后2、5和10周的外植体的大体外观。(B)植入后2、5和10周3D生物打印结构的尺寸变化和(C)压缩弹性模量(*p<0.05，**N.S.：不显著）
组织学分析显示，在GG/FB4和混合结构中形成了纤维软骨样组织(图6A，B)。两组GAG和胶原基质的产生分别用藏红素O染色和Masson三色染色证实。定量显示GAG和胶原基质的产生随着时间的延长而增加(图6C，D)。结果表明，植入后10周，杂化支架的GAG含量(0.4±0.0 1μg/mg)和胶原含量(4.71±0.15μg/mg)明显高于其他支架。正如预期的那样，没有细胞的GG/FB4结构产生的细胞外基质较少，组织学分析仅显示宿主组织浸润(图S5)。
图6.3D生物打印杂交构建物的组织学和生化检查。植入2、5和10周后(A)GG/FB4和(B)杂化构建物的3D生物打印的组织学图像(比例尺：200μm)。在植入后2、5和10周，定量测定生物印迹构建体的(C)GAG和(D)胶原产量；无细胞的SIL-MA(H)、GG/FB4、杂交体和GG/F4(*p<0.05与GG/FB4(-cells)相比，**p<0.05与SIL-MA(H)相比，以及*p<0.05与其他组相比)。
为了检查胶原组织的成熟度，研究团队用阿尔新蓝/天狼星红染色进行了成像分析。染色后的标本在偏振光下观察，分析胶原基质(图7A，B)。在Pmicrosirius Red偏振检测方法中，I型胶原纤维被指定为黄红色双折射，而III型胶原纤维表现为弱双折射，并与绿色相关。49图7C，D描绘了每种胶原纤维颜色在GG/FB4和混合结构中的平均百分比。结果证实，在植入的10周内，两种结构的颜色都从绿色变为红色，这表明组织成熟了，胶原纤维也成熟了。
图7.植入2、5和10周后，3D生物打印结构中偏振的PMicro Sirius Red染色的胶原纤维的定量。生物打印的(A)GG/FB4和(B)杂交结构(比例尺：100μm)的未偏振和偏振的阿尔新蓝/天狼星红染色图像。使用自定义MATLAB代码计算(C)GG/FB4和(D)混合结构中每种胶原纤维颜色的平均百分比。(E)典型偏振图像(比例尺：20μm)和(F)植入后10周和天然(猪半月板)生物打印结构的比对分析(*与GG/FB4，N.S.相比，P<0·05：没有显著性)。
新型生物墨水开发过程中的材料选择是成功实现细胞载体生物印刷的关键步骤。本研究选择FB和GG作为细胞载体生物墨水。FB是一种在3D细胞培养实验中被广泛用作水凝胶的蛋白质，主要是因为它与凝血酶的简单凝胶过程和固有的细胞粘附能力。然而，基于FB的水凝胶结构在水条件下收缩和纤溶酶快速降解而在结构维护方面的应用有限。另外，GG是一种阴离子多糖，由于其良好的生物相容性和机械性能，目前已被用作水凝胶和生物墨水GG是一种温度敏感材料，由于其可逆的物理交联，在较低温度下比在较高温度下粘度更高。因此，我们预计这种FB和GG的复合物可以提供用于3D生物打印应用的增强的细胞粘附能力和机械稳定性。此外，可以预见，通过离子相互作用和凝血酶处理，GG/FB复合结构显示出更好的结构稳定性和力学性能。
为了避免猪细胞来源加剧宿主免疫反应，研究团队使用免疫受损的动物模型在体内验证生物印记的细胞负载的杂交结构。虽然这个动物模型使我们能够确定生物打印组织结构中半月板组织的成熟和形成，但未来使用自体细胞来源的临床前大型动物研究将是强制性的，以检查半月板缺损损伤后的宿主反应和功能恢复。
为了将来的临床应用，生物工程组织构造物应该具有适当的生物学特性，以确保植入物与邻近组织的整合。此外，植入组织构造物的力学行为应该量身定做，以匹配邻近组织，提供直接的机械功能。以前的工作证明，将自然衍生材料与合成聚合物结合作为杂化生物材料系统，用于各种组织工程应用；然而，这些方法中的一些方法揭示了由于刚度不足和缺乏可调整性而导致与天然组织的机械不匹配。因此，我们认为GG/FB和sIL-MA的组合具有很强的通用性和能力，能够产生具有合适的生物和力学性能的患者特异性组织结构，用于纤维软骨组织的再生。这些自然衍生的生物材料可以更好地模拟自然微环境，加强与周围组织的整合。