撰文 | 十一月
责编 | 兮
细胞核内区室分隔（Compartments）在调节基因表达方面具有多种不同的作用，但是目前驱动区室形成的具体分子力以及相关组分还很不清楚【1】。长非编码RNA Xist通过高浓度定位在X染色体内转录位点以及结合多种蛋白促进X染色体失活（X-chromosome inactivation，XCI）。因此，XCI过程也被认为是理解RNA介导的蛋白招募驱动功能性区室化的研究范式。
为了揭开XCI过程中RNA对于促进细胞核内区室化形成过程的具体分子机制，近日，美国加州大学洛杉矶分校Kathrin Plath研究组与Douglas. L. Black研究组合作发文题为A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing，发现Xist通过招募多种RNA结合蛋白组成的异质性凝聚物（Condensates）促进可遗传的基因沉默以及表观遗传记忆的维持。
不活跃的X染色体区室的性质会随时间而改变，在初始Xist的传播和转录关闭后达到了一种状态，在这种状态下即使Xist被关闭基因沉默仍然保持稳定【2】。也就是说尽管Xist结合的蛋白比如PTBP1、MATR3、TDP-43或者是CELF1在XCI过程中具有一定的功能，但是当X染色体失活相关的基因沉默状态形成后（去除这些RNA结合蛋白）并不影响X染色体失活的状态。这一现象给作者们带来了一个问题，那就是这些RNA结合蛋白在XCI过程中的具体功能究竟是什么。因为Xist其中包含几个高度重复的序列【3】，所以作者们希望通过对Xist与这些RNA结合蛋白之间的相互作用进行解析，来探究这些组分是否通过建立一个高阶的复合物促进X染色体失活现象中的区室化的形成。
通过siRNA对以上提到的四个RNA结合蛋白分别进行敲低后，作者们发现Xist信号会出现一定程度的弥散，说明这四个RNA结合蛋白在形成失活的X染色体方面介导Xist的定位。进一步地，作者们想通过CLIP-seq（Crosslinking immunoprecipitation followed by sequencing）技术确认这四个RNA结合蛋白结合在Xist的具体哪些位置，作者们发现它们均结合在Xist的E-repeat序列上。这些结果说明Xist E-repeat作为这些RNA结合蛋白的多价结合平台发挥作用。
为了确认E-repeat序列的功能，作者们建立了一个E-repeat序列敲除的胚胎干细胞品系称为XistΔE。在胚胎干细胞分化的最开始3天内，XistΔE品系与野生型中Xist区域又称为Xist云（Clouds）并没有太大差别，但是Xist被逐渐招募到了核纤层区域附近。在分化四至七天之后，Xist云出现明显的下降。随后作者们确认了这种降低并不是由于Xist丰度的降低、剪接过程的缺陷或者是RNA稳定性降低引起的。这说明，E-repeat序列对于Xist最初在整个X染色体上的传播并非关键因素，但是对于随后的Xist点状聚集稳定维持以及X染色体上区室的形成非常重要。也即是说，X染色体的区室分隔包括两个阶段，一个是不依赖于E-repeat的阶段，另一个是依赖于E-repeat的重组装阶段。
随后，作者们希望对E-repeat缺失后的对于X染色体上的基因沉默的影响进行解析。通过对五个XCI过程相关基因的转录本进行检测后作者们发现，E-repeat缺失后会使得这些基因在分化后期阶段（4-7天）中没有办法维持沉默状态。因此，E-repeat对于维持Xist包裹是非常关键的，与Xist介导的基因沉默以及表观遗传记忆息息相关。
先前的研究发现，PTBP1在体外可以与RNA结合形成液-液相分离的混合物【4】。这引起了作者们的兴趣，他们想知道PTBP1是否通过与Xist E-repeat形成相分离的液滴来促进Xist点状聚集的形成。通过蛋白纯化以及体外液滴实验检测，作者们发现PTBP1与E-repeat RNA的确能够形成相分离的液滴并且这些液滴能够发生融合现象，证明了其液态的特征（图1）。另外，通过对其他的RNA结合蛋白的纯化，作者们发现其他RNA结合蛋白的加入会降低各个因子促进凝聚物诱导形成的阈值。对这些RNA结合蛋白中的多聚化或者二聚化位点的突变，会影响液滴的形成。因此，作者们得出结论，通过高密度地结合在E-repeat序列上，Xist招募聚集如PTBP1、MATR3、TDP-43或者是CELF1这些RNA结合蛋白建立Xist区室分隔，促进XCI相关的基因沉默。
图1 PTBP1与E-repeat RNA在体外形成相分离的液滴
总的来说，Plath研究组与Black研究组合作的工作发现Xist RNA结合蛋白通过与Xist上E-repeat多价序列结合组装成为高阶复合物，形成失活X染色体上的聚集物，对于维持基因沉默以及Xist的锚定到X染色体失活区域非常重要（图2）。该工作揭开了RNA介导相分离过程驱动细胞核内区室化分隔，鉴定出了一个意料之外的RNA结合蛋白参与的基因表达以及表观遗传记忆调节的分子机制。
图2 工作模型
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2703-0
制版人：Kira
参考文献
1. Strom, A. R. & Brangwynne, C. P. The liquid nucleome - phase transitions in the nucleus at a glance.Journal of cell science132, doi:10.1242/jcs.235093 (2019).
2. Wutz, A. & Jaenisch, R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation.Molecular cell5, 695-705, doi:10.1016/s1097-2765(00)80248-8 (2000).
3. Brockdorff, N. Local Tandem Repeat Expansion in Xist RNA as a Model for the Functionalisation of ncRNA.Non-coding RNA 4, doi:10.3390/ncrna4040028 (2018).
4. Li, P. et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins.Nature483, 336-340, doi:10.1038/nature10879 (2012).