生物3D打印需要具有剪切稀释性、适当的可塑强度和快速自愈的生物相容性水凝胶油墨。然而，缺乏理想的生物打印油墨，具有优异的打印性能和高的结构保真度，以及细胞相容性，阻碍了基于挤压的3D生物打印在组织工程中的发展。
本研究开发了一种新型的壳聚糖-甲基丙烯酸甲酯-聚乙烯醇杂化水凝胶自愈合预交联凝胶微粒(PCH-μPs)，并将其作为生物墨水用于高保真度、高生物相容性的支架挤出三维打印。PCHμPs在通过注射器注射时表现出极好的剪切稀释性，随后随着剪切力的消除而自我愈合到凝胶中。
数值模拟结果表明，PCHμPs在喷嘴内的流动扰动很小，有利于实现稳定连续的印刷。此外，PCHμPs显示出自支撑屈服强度(540Pa)，这对印刷构件的保真度至关重要。用PCHμP油墨直接打印出了一系列具有很大长径比和精细结构的仿生结构。3D打印支架支持骨髓间充质干细胞的生长和细胞球体的形成，这是组织工程中最重要的。
用来支持和促进细胞增殖和分化的仿生支架目前已经被用作组织甚至器官再生。然而，创造支架来复制或模拟组织和器官的复杂结构和生物功能一直是具有挑战性的。3D生物打印已经成为在3D中精确定位材料、结构和功能的一种很有前途的方法，理想地可以制造用于组织工程、药物筛选、和人工器官的仿生构造。3D打印支架不仅应该支持细胞生长，还应该提供化学、物理和生物利基来引导干细胞分化为靶细胞。
然而，到目前为止，许多用作生物印刷油墨的水凝胶和前驱体都是通过相变或UV固化而固化的，这通常需要几分钟的时间或对细胞有害。温度敏感型明胶、Pluronic F127及其衍生物在高浓度下印，并在高温下固化。有时会加入增粘剂以帮助水凝胶在印刷过程中保持其形状。此外，一些牺牲支持聚合物被用来增韧用于3D生物打印的离子或UV交联水凝胶。在打印前、打印过程中和打印后使用UV交联来增加材料粘度和打印结构的强度或保真度。然而，优化粘度、剪切强度、压力和保真度是具有挑战性的。人们必须仔细平衡水凝胶的粘度、溶胶-凝胶转变和强度，才能实现可接受的印刷。
DOI: 10.1002/adfm.201910573
可逆的非共价相互作用，包括动态键、氢键、静电相互作用、主客体相互作用。最近在水凝胶中引入了识别和协调，以实现高质量的生物打印。许多非共价相互作用是动态的、可逆的、容易损坏的，并且在环境条件下容易恢复或自我愈合。然而，大多数基于非共价相互作用的水凝胶都很脆弱，而且恢复或自愈需要很长时间，这阻碍了三维生物打印的成功。最近，非共价相互作用和网络结构的结合已被证明可以制备具有优异机械性能的自愈合水凝胶，可以提供高强度和高保真度的印刷结构。
基于挤压的3D生物打印的主要特征是，在通过喷嘴挤出并沉积在基底上之前，材料通过注射器稳定流动。这种液体可能是胶体液体。与流体中的聚合物链不同，胶体要大得多(几微米到几十微米)，并且可以携带丰富的官能团来调节胶体之间的相互作用。因此，可以方便地利用胶体之间的集体相互作用来实现剪切变稀、快速自愈和优异的力学性能。这样的水凝胶颗粒可以很容易地通过30g的针用低挤出力注射。颗粒之间的氢键、静电相互作用、客体-宿主化学和硫醇-烯点击化学在高剪切时破裂，一旦去除剪切就会迅速恢复。然而，由于大多数水凝胶颗粒很弱和脆弱，这样的水凝胶胶体在打印几层后不能维持其自身的重力。
为了解决这些问题，Hua Zhang 团队采用力学性能优异、常温下快速自愈的水凝胶微粒作为三维生物打印墨水构建仿生支架。壳聚糖甲基丙烯酸酯(CHMA)和聚乙烯醇(PVA)都是已知的生物相容性聚合物，通过配制CHMA的化学交联和PVA的冻融物理交联，制备出力学性能可调的水凝胶(图1)。然而，化学交联的CHMA/PVA水凝胶不流动，不适合3D打印。
因此，复合水凝胶可控制地裂解成微粒。这些颗粒能够通过壳聚糖和PVA链之间广泛的氢键结合成水凝胶(图1)。这种颗粒水凝胶在零剪切时是坚固的，但在高剪切时表现出典型的触变性行为，并随着剪切的消失而迅速自愈成为坚固的凝胶。根据数值模拟，喷嘴内剪切作用下的颗粒表现为一种推流剖面。这样的插流剖面保护了大多数颗粒不受拉伸和剪切流动的影响，从而改善了微粒水凝胶的稳定和连续打印。印刷了多种仿生结构，具有出色的自支撑性、高纵横比和复杂的结构。该支架可诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)形成细胞球体，具有良好的组织工程应用前景。
图1.3D打印用自愈预交联水凝胶微粒(PCHμPs)的制备示意图。交联CHMA/PVA杂化水凝胶的a)网络结构和b)化学结构。C)水凝胶被裂解成微粒，这些微粒通过氢键聚集成凝胶。D)PCHμP凝胶用于基于挤出的支架3D打印。E)冷冻/解冻用于进一步加强支架以支持细胞粘附和生长。
将甲基丙烯酸甲酯与聚乙烯醇在水溶液中共混，在引发剂I1173存在下，用365nmUV光(10 mW cm2)引发自由基聚合，生成刚性水凝胶。根据1HNMR测量，通过N-酰化反应制备了壳聚糖甲基丙烯酸甲酯，其中≈的取代度为22.6%。在水凝胶中，CHMA链是化学交联的，并与PVA链形成氢键。根据流变测量，CHMA/PVA水凝胶的模量约为3kPa，直到200%应变时才失效(图2a)。这种凝胶不适合3D打印，而且实际上无法从3D打印机的喷嘴挤出。
图2.a)PCHCHMA P凝胶和μ/PVA水凝胶(1wt%CHMA，8wt%PVA)在37°C下的应变扫描；b)CHMA/PVA微粒的偏光显微镜图像。C)PCHμP凝胶在37°C下以1%和10%应变循环剪切时的可逆凝胶-溶胶转变和自愈。d)PCHμP稳定流出喷嘴。
根据生理温度(37°C)下的流变测试，PCH-μ-P材料表现出典型的剪切变稀和屈服行为。图3a比较了PCHCHMA P材料在1%应变下具有不同μ浓度的粘度-剪切速率关系。当μ浓度从0.5增加到0.75和1.0wt%时，材料的零剪切粘度从778分别增加到5306和23 522Pas。随着CHMA浓度的增加，粒子间的固有氢键和粘附性增强。当剪切速率增加到0.01s1以上时，粘度显著降低，表现为剪切稀化行为。稳定的连续剪切破坏了颗粒之间的相互作用，并可能使PCHμPs对齐流动。
图3.PCHμPS油墨的流变特性。A、b)分别用剪切速率扫描和剪切应力扫描描述了PCHμPs油墨的剪切变稀特性和屈服区。(3)用Herschel-Bulkley流体模型拟合切应力与切变率的关系。D)在37°C施加1Pa应力的PCHμPs油墨的典型蠕变和恢复曲线。
这些模拟结果揭示了微粒水凝胶在喷嘴中屈服后的流动行为。中心剪切速率较低的稳定塞状流最有可能保持类水凝胶状态，可以保护大部分水凝胶变形不受挤压，从而提高印刷保真度。此外，根据流变测试(图3b)，PCHμPs在喷嘴中经历的最大剪应力估计接近1800Pa(图4d)，超过了1.0wt%PCHμP凝胶的屈服强度(540Pa)，这表明很容易通过喷嘴挤出。
图4.使用赫歇尔-布克利流体模型对喷嘴中1.0%PCHμP油墨的流变性进行模拟预测。A)实验条件(0.15mLmin1，37°C下2 mm s1)下的剪切速率分布。B)挤出印刷过程中，PCHμP油墨在0.1mL至0.4mLmin1不同流速下的二维剪切速率分布。C)37°C下0.15mLminμ1挤出机尖端PCHP油墨的剪切应力分布。
PCHμP材料的剪切变薄、快速自愈和屈服强度使其能够通过3D生物打印来制造各种仿生结构。例如，一个3.0x3.0mm2的PCHμPs网，其灯丝间距为≈500mm2，其高分辨率已经被图案化，这通过使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，图5)进行了表征。凭借PCHμP油墨的高强度和自愈性，细丝在保持尖锐形状的同时彼此紧密粘合。此外，孔径为12×12×2mm3和250mm3的立方体被精确构建，没有进一步的交联(图5b)。由于微粒凝胶的高屈服强度，新打印的结构在挤压后很好地支撑了它们自身的重力，并导致了高结构保真度。据我们所知，除非生物墨水在打印过程中或之后进一步交联，否则很少有关于将生物墨水直接打印到自由结构中的报道。
图5.a)单层pchμps网和b)3D打印的大型多层支架的共聚焦激光扫描显微镜图像。
图6.3D打印后，复杂的仿生结构显示了PCHμP生物墨水的机械完整性。A)打印的35层圆柱体，b)采用共聚焦激光扫描显微镜的底视图，c)大鼠大小的大腿骨，d)真人大小的耳朵模型
图7.CHMA/PVA支架的细胞粘附响应特性。A)骨髓间充质干细胞粘附在CHMA/PVA支架上的荧光显微镜图像(细胞骨架为红色，细胞核为DAPI)。B)细胞数量分布和c)染色的细胞核和细胞骨架在1、3和7d计数各球体的黏附面积。
目前的研究展示了一种剪切响应型聚氯乙烯μP油墨通过使用紫外光交联，水溶性的甲基丙烯酸甲酯和聚乙烯醇杂化水凝胶。甲基丙烯酸甲酯/聚乙烯醇的PCHμP油墨经历了剪切变稀、凝胶-溶胶转变，具有良好的屈服强度，这使得基于挤出的3D打印可以通过插头流动进行，从而保证了出色的打印适性和保真度。
这一新的3D打印策略可以方便而通用地制造结构复杂、高纵横比和与器官相关的尺度(包括血管、人耳和大鼠股骨)的出色形状保真度的结构。CHMA/PVA支架良好地支持了骨髓间充质干细胞和球体的生长。研究团队提出这种新的3D生物打印墨水可以用于有机物和组织工程。