Introduction
癌症是全球最主要的死亡原因之一，而结肠癌是癌症死亡的三大常见原因之一。结肠腺癌是常见的肿瘤之一，发生在人体结肠内壁。结肠癌的常规治疗包括手术、化疗和放疗，但由于这些治疗方法副作用大、生存率低、复发率高、临床疗效有限，因此效果并不理想。因此，有必要开发新颖有效的治疗策略。最近的研究集中表明，在食品中发现的几种生物活性天然化合物具有抗癌和抗氧化的活性，在体外研究中能抑制癌细胞增殖。从天然产物中提取的抗肿瘤药物具有许多优点，如能针对多种癌症、毒性低、副作用有限、产生耐药性的几率较低。
枳树（Poncirus trifoliata (L.) Raf.，又称枸橘Citrus trifoliata）是芸香科植物，长久以来一直被用作抗炎、抗过敏药，治疗胃肠道疾病（如消化不良、便秘等）和肺部疾病（如胸闷、胸痛、支气管炎、痰多等）。最近的研究表明，枸橘的药理作用因其果实的成熟度和活性成分（甲醇、乙醇、25-methylmelianodiol/21β-methylmelianodiol和水提取物）的不同而不同。枸橘的成熟形态对炎症细胞和癌细胞的影响是多种多样的。然而，目前鲜有关于枸橘未成熟果实的抗结肠癌活性的研究。因此，韩国全北国立大学临床医学研究所和生物医学研究所的Sun-Young Kim、Min Sun Kim等，在本研究中评价了枸橘未成熟果实的甲醇提取物（MEPT）对结直肠癌细胞系的抗肿瘤作用，并探讨了枸橘未成熟果实的分子机制。本研究可为MEPT的基础研究和临床试验提供支持。
Results
MEPT抑制结直肠癌细胞的生长和增殖
首先研究了MEPT对CT-26、HCT-116和DLD-1细胞生长的影响。使用不同浓度的MEPT（0、1、5、10、20 μmol/L），不同的时间长度（0、1、2、3天）。如图1A～1C所示，在实验的3 天时间内，CT-26、HCT-116和DLD-1细胞经MEPT处理后，其生长明显下降，呈剂量依赖性（P＜0.05）。在CT-26细胞中，处理24 h后，10 μmol/L时生长抑制率最高为（58.40±4.74）%，但10 μmol/L和20 μmol/L时的抑制效果无显著差异。用20 μmol/L MEPT处理48 h后，CT-26细胞生长约为对照组的（74.14±1.89）%，为最明显的抑制率。处理48 h后，CT-26细胞以剂量依赖性的方式收缩，活细胞数量明显减少（图1D）。该化合物的制备方法如图1E所示。
A. CT-26细胞；B. HCT-116细胞；C. DLD-1细胞；D. CT-26细胞；E.准备MEPT的程序图。
图1 MEPT抑制CT-26细胞的存活和增殖
MEPT通过Akt/mTOR和AMPKα途径抑制CT-26细胞的生长和增殖
为了了解MEPT抑制CT-26细胞生长和增殖的分子机制，本研究进行了蛋白质印迹实验。研究发现，在CT-26细胞中，随着MEPT浓度的增加，Akt和mTOR的磷酸化程度显著降低，而AMPKα的磷酸化程度则增加（图2A）。此外，AMPKα的磷酸化水平以时间依赖性的方式增加（图2B）。
A.不同浓度的MEPT处理细胞6 h，图像显示相对于CT-26细胞中P-Akt，P-AMPKα和P-mTOR表达的蛋白质印迹；B.不同浓度的MEPT处理8 h和12 h的细胞中P-AMPKα和P-mTOR表达的蛋白质印迹。
图2 MEPT通过抑制Akt/mTOR途径抑制CT-26细胞的生长和增殖
MEPT诱导CT-26细胞凋亡
通过Hoechst 33342染色，增加MEPT的剂量导致核浓缩和碎片化，与对照组相比（图3A）。此外，研究还发现，MEPT以剂量依赖性的方式显著下调了pro-caspase 3和pro-PARP的表达，而裂解caspase 3的上调与阿霉素处理的CT-26细胞相似（图3B）。图3C显示，MEPT处理伴随着细胞液中细胞色素c和Smac/DIABLO的上调，以及线粒体颗粒中它们的下调。在MEPT处理后12 h开始，强烈观察到细胞液中细胞色素c和Smac/DIABLO的存在。此外，CT-26细胞中裂解caspase 9的表达被促进。根据流式细胞仪分析，与未处理的对照组相比，MEPT处理的细胞增加了凋亡细胞的数量（图3D）。这些结果表明，MEPT以剂量依赖性方式诱导CT-26细胞凋亡。
A. Hoechst 33342染色CT-26细胞以评估细胞凋亡并在荧光显微镜下检查；B.增加的MEPT浓度处理的CT-26细胞中pro-caspase 3、裂解caspase 3和pro-PARP的表达；C. MEPT处理后3、6、12、24 h出现Smac/DIABLO、细胞色素c和裂解caspase 9；D. CT-26细胞用Annexin V染色并通过流式细胞仪分析。
图3 MEPT对CT-26细胞凋亡的影响
MEPT诱导CT-26细胞的自噬作用
MDC染色显示，MEPT处理8 h后，MDC标记的囊泡（自噬空泡）数量增加，呈剂量依赖性（图4A）。值得注意的是，MEPT处理后，自噬相关关键蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62、ATG-5和LC3AB的表达明显上调，与阿霉素处理相似，且处理8 h后比12 h后更强（图4B），说明MEPT诱导自噬。
A.不同浓度MEPT处理8 h后，CT-26细胞的MDC染色的代表性图像；B.蛋白质印迹显示Beclin-1、SQSTM1/p62、ATG-5和LC3AB在不同浓度MEPT处理8 h或12 h，和2 μg/mL阿霉素处理8 h的CT-26细胞中的表达。
图4 MEPT对CT-26细胞自噬的影响
MET通过线粒体途径促进CT-26细胞凋亡
MEPT处理降低了pro-caspase 3和pro-PARP的水平，并以时间依赖的方式增加了SQSTM1/p62和LC3AB的水平（图5）。为了进一步研究MEPT诱导的细胞凋亡，研究在MEPT治疗前1 h用碳苯氧-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲基]-氟甲基酮（Z-VAD-fmk，一种ccaspase抑制剂）或3-甲基腺嘌呤（3-MA，一种III型磷脂酰肌醇3-激酶[PI3K]抑制剂）对CT-26细胞进行预处理。发现Z-VAD-fmk处理后，pro-caspase 3和pro-PARP水平没有变化，3-MA处理后，SQSTM1/p62和LC3AB、pro-aspase 3和pro-PARP水平没有变化。
图5 经MEPT处理的CT-26细胞凋亡和自噬标记的蛋白质印迹分析
Conclusion
本研究首次描述了未成熟的枸橘果实提取物触发CT-26结直肠癌细胞的自噬和凋亡。MEPT通过激活AMPK和抑制PI3K/Akt/mTOR途径，诱导自噬和凋亡，抑制结直肠癌细胞的增殖，从而有助于抑制肿瘤。此外，这些效应还通过自噬、线粒体信号传导以及细胞色素c和Smac/DIABLO蛋白的释放与随后的凋亡过程的激活继续进行。自噬则会诱导细胞死亡。基于这些结果，本研究结果认为MEPT可以作为一种有用的天然化合物进行研究，用于治疗结直肠癌。
该文章《The extract of the immature fruit of Poncirus trifoliata induces apoptosis in colorectal cancer cells via mitochondrial autophagy》于2020年5月15日在线发表于Food Science and Human Wellness。
翻译：梁安琪；编辑：袁月；责编：张睿梅
图片来源于文章原文
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