FSHW:枸橘未成熟果实的提取物通过线粒体自噬诱导结肠癌细胞凋亡

subtitle 食品科学杂志 10-19 14:20

Introduction

癌症是全球最主要的死亡原因之一,而结肠癌是癌症死亡的三大常见原因之一。结肠腺癌是常见的肿瘤之一,发生在人体结肠内壁。结肠癌的常规治疗包括手术、化疗和放疗,但由于这些治疗方法副作用大、生存率低、复发率高、临床疗效有限,因此效果并不理想。因此,有必要开发新颖有效的治疗策略。最近的研究集中表明,在食品中发现的几种生物活性天然化合物具有抗癌和抗氧化的活性,在体外研究中能抑制癌细胞增殖。从天然产物中提取的抗肿瘤药物具有许多优点,如能针对多种癌症、毒性低、副作用有限、产生耐药性的几率较低。

枳树(Poncirus trifoliata (L.) Raf.,又称枸橘Citrus trifoliata)是芸香科植物,长久以来一直被用作抗炎、抗过敏药,治疗胃肠道疾病(如消化不良、便秘等)和肺部疾病(如胸闷、胸痛、支气管炎、痰多等)。最近的研究表明,枸橘的药理作用因其果实的成熟度和活性成分(甲醇、乙醇、25-methylmelianodiol/21β-methylmelianodiol和水提取物)的不同而不同。枸橘的成熟形态对炎症细胞和癌细胞的影响是多种多样的。然而,目前鲜有关于枸橘未成熟果实的抗结肠癌活性的研究。因此,韩国全北国立大学临床医学研究所和生物医学研究所的Sun-Young Kim、Min Sun Kim等,在本研究中评价了枸橘未成熟果实的甲醇提取物(MEPT)对结直肠癌细胞系的抗肿瘤作用,并探讨了枸橘未成熟果实的分子机制。本研究可为MEPT的基础研究和临床试验提供支持。

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Results

MEPT抑制结直肠癌细胞的生长和增殖

首先研究了MEPT对CT-26、HCT-116和DLD-1细胞生长的影响。使用不同浓度的MEPT(0、1、5、10、20 μmol/L),不同的时间长度(0、1、2、3天)。如图1A~1C所示,在实验的3 天时间内,CT-26、HCT-116和DLD-1细胞经MEPT处理后,其生长明显下降,呈剂量依赖性(P<0.05)。在CT-26细胞中,处理24 h后,10 μmol/L时生长抑制率最高为(58.40±4.74)%,但10 μmol/L和20 μmol/L时的抑制效果无显著差异。用20 μmol/L MEPT处理48 h后,CT-26细胞生长约为对照组的(74.14±1.89)%,为最明显的抑制率。处理48 h后,CT-26细胞以剂量依赖性的方式收缩,活细胞数量明显减少(图1D)。该化合物的制备方法如图1E所示。

A. CT-26细胞;B. HCT-116细胞;C. DLD-1细胞;D. CT-26细胞;E.准备MEPT的程序图。

图1 MEPT抑制CT-26细胞的存活和增殖

MEPT通过Akt/mTOR和AMPKα途径抑制CT-26细胞的生长和增殖

为了了解MEPT抑制CT-26细胞生长和增殖的分子机制,本研究进行了蛋白质印迹实验。研究发现,在CT-26细胞中,随着MEPT浓度的增加,Akt和mTOR的磷酸化程度显著降低,而AMPKα的磷酸化程度则增加(图2A)。此外,AMPKα的磷酸化水平以时间依赖性的方式增加(图2B)。

A.不同浓度的MEPT处理细胞6 h,图像显示相对于CT-26细胞中P-Akt,P-AMPKα和P-mTOR表达的蛋白质印迹;B.不同浓度的MEPT处理8 h和12 h的细胞中P-AMPKα和P-mTOR表达的蛋白质印迹。

图2 MEPT通过抑制Akt/mTOR途径抑制CT-26细胞的生长和增殖

MEPT诱导CT-26细胞凋亡

通过Hoechst 33342染色,增加MEPT的剂量导致核浓缩和碎片化,与对照组相比(图3A)。此外,研究还发现,MEPT以剂量依赖性的方式显著下调了pro-caspase 3和pro-PARP的表达,而裂解caspase 3的上调与阿霉素处理的CT-26细胞相似(图3B)。图3C显示,MEPT处理伴随着细胞液中细胞色素c和Smac/DIABLO的上调,以及线粒体颗粒中它们的下调。在MEPT处理后12 h开始,强烈观察到细胞液中细胞色素c和Smac/DIABLO的存在。此外,CT-26细胞中裂解caspase 9的表达被促进。根据流式细胞仪分析,与未处理的对照组相比,MEPT处理的细胞增加了凋亡细胞的数量(图3D)。这些结果表明,MEPT以剂量依赖性方式诱导CT-26细胞凋亡。

A. Hoechst 33342染色CT-26细胞以评估细胞凋亡并在荧光显微镜下检查;B.增加的MEPT浓度处理的CT-26细胞中pro-caspase 3、裂解caspase 3和pro-PARP的表达;C. MEPT处理后3、6、12、24 h出现Smac/DIABLO、细胞色素c和裂解caspase 9;D. CT-26细胞用Annexin V染色并通过流式细胞仪分析。

图3 MEPT对CT-26细胞凋亡的影响

MEPT诱导CT-26细胞的自噬作用

MDC染色显示,MEPT处理8 h后,MDC标记的囊泡(自噬空泡)数量增加,呈剂量依赖性(图4A)。值得注意的是,MEPT处理后,自噬相关关键蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62、ATG-5和LC3AB的表达明显上调,与阿霉素处理相似,且处理8 h后比12 h后更强(图4B),说明MEPT诱导自噬。

A.不同浓度MEPT处理8 h后,CT-26细胞的MDC染色的代表性图像;B.蛋白质印迹显示Beclin-1、SQSTM1/p62、ATG-5和LC3AB在不同浓度MEPT处理8 h或12 h,和2 μg/mL阿霉素处理8 h的CT-26细胞中的表达。

图4 MEPT对CT-26细胞自噬的影响

MET通过线粒体途径促进CT-26细胞凋亡

MEPT处理降低了pro-caspase 3和pro-PARP的水平,并以时间依赖的方式增加了SQSTM1/p62和LC3AB的水平(图5)。为了进一步研究MEPT诱导的细胞凋亡,研究在MEPT治疗前1 h用碳苯氧-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲基]-氟甲基酮(Z-VAD-fmk,一种ccaspase抑制剂)或3-甲基腺嘌呤(3-MA,一种III型磷脂酰肌醇3-激酶[PI3K]抑制剂)对CT-26细胞进行预处理。发现Z-VAD-fmk处理后,pro-caspase 3和pro-PARP水平没有变化,3-MA处理后,SQSTM1/p62和LC3AB、pro-aspase 3和pro-PARP水平没有变化。

图5 经MEPT处理的CT-26细胞凋亡和自噬标记的蛋白质印迹分析

Conclusion

本研究首次描述了未成熟的枸橘果实提取物触发CT-26结直肠癌细胞的自噬和凋亡。MEPT通过激活AMPK和抑制PI3K/Akt/mTOR途径,诱导自噬和凋亡,抑制结直肠癌细胞的增殖,从而有助于抑制肿瘤。此外,这些效应还通过自噬、线粒体信号传导以及细胞色素c和Smac/DIABLO蛋白的释放与随后的凋亡过程的激活继续进行。自噬则会诱导细胞死亡。基于这些结果,本研究结果认为MEPT可以作为一种有用的天然化合物进行研究,用于治疗结直肠癌。

该文章《The extract of the immature fruit of Poncirus trifoliata induces apoptosis in colorectal cancer cells via mitochondrial autophagy》于2020年5月15日在线发表于Food Science and Human Wellness。

翻译:梁安琪;编辑:袁月;责编:张睿梅

图片来源于文章原文

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