撰文 | Qi
责编 | 兮
大多数动物都表现出外部双侧对称性，但是体内往往存在多个器官（例如心脏）的左右不对称分布（L-R asymmetries）【1】。在斑马鱼胚胎发育时期，左右对称性的首次打破发生在Kupffer囊泡中（引导L–R发育的纤毛器官），随后L–R信息通过生长因子Nodal的不对称表达传递至到左外侧板中胚层（left lateral plate mesoderm, LPM），进而导致大脑，心脏和其他结构的正确分布。如何确定胚胎发育过程中器官的偏侧性（laterality）是一个非常有趣的问题，然而至今仍存在大量悬而未决的难题。
2017年，来自西班牙UMH-CSIC神经科学研究所的M. Angela Nieto课题组（下文简称为Ocaa等）在Nature杂志上发表了一篇题为“A right-handed signalling pathway drives heart looping in vertebrates”的文章【2】，该研究基于斑马鱼胚胎的LPM中配对样同源盒转录因子（paired-like homeobox transcription factor）Prrx1a的瞬时右偏表达，使用针对prrx1a的剪接和翻译阻断剂吗啉代寡核苷酸（morpholinos, MO1）来抑制其功能，报道注射这一阻断剂的幼体出现心脏偏侧缺陷。此外，向斑马鱼胚胎注射single-guide RNA和cas9蛋白以诱导prrx1a发生体细胞突变，也同样观察到类似缺陷。因而得出结论，prrx1a在驱动心脏环化（cardiac looping）的新型右手型信号通路（right-handed signalling pathway）中的作用。
但是关于这篇文章的结论，来自南加州大学凯克医学院的J. Gage Crump课题组和来自荷兰皇家科学院Hubrecht研究所的Jeroen Bakkers课题组（以下简称为Tessadori等）提出了质疑，并于2020年9月23日于Nature杂志上发表题为“Zebrafish prrx1a mutants have normal hearts”的文章【3】，表示没有发现prrx1a在建立驱动斑马鱼心脏环化的右旋信号通路中的作用。
Tessadori等先前报道了分别通过TALENs和CRISPR–Cas9产生的prrx1a的两种种系移码突变（germline frameshift mutant）：prrx1ael558和prrx1ab1246，这些等位基因预计消除整个DNA结合域，类似于Ocaa等在研究中所使用的MO1的预期效果。然而，结果显示发现prrx1ael558和prrx1ab1246在任何阶段都未能导致明显的形态缺陷，且仅与prrx1b突变等位基因结合才会导致颅面缺陷【4】。
随后，Tessadori等也对斑马鱼胚胎注射MO1和sgRNA–Cas9，但是与Ocaa等人的结果相反，prrx1ael558和prrx1ab1246的纯合突变体胚胎在受精后（post-fertilization, hpf）26小时时线性心管向左移位正常（称为left cardiac“jogging”），在50 hpf时右旋心脏环化正常。在prrx1ael558突变体中，心管形成之前LPM中lefty2（lft2）的表达也不受影响。Tessadori等认为心脏表型的缺失并不是由于旁系同源物prrx1b或母体提供的prrx1a所补偿，因为在prrx1ael558 / el558; prrx1bel491 / el491双重突变体和从纯合突变体母体中获得的prrx1ael558 / el558胚胎中，心脏环化同样不受影响。
需要注意的是，尽管MO1和相关的反义试剂已被广泛用于抑制许多脊椎动物的基因功能。在某些情况下，其导致的表型也未能在相应的纯合功能丧失的斑马鱼突变体中观察到，即使蛋白功能已被验证完全丧失【5,6】。接下来为了测试Ocaa等使用的prrx1a剪接阻断剂MO1（prrx1a-MO1）的特异性，Tessadori等将其滴定并注入野生型胚胎中，并证实其报道的对心脏环化的效应。然而当将prrx1a-MO1注入prrx1ael558合子突变胚胎中，也能观察到对心脏环化的相同影响，这表明观察到的心脏偏侧性缺陷可能不是由prrx1a的敲低引起的。类似的，当prrx1ael558 / el558和prrx1bel491 / el491双突变体时也获得了一致的结果。
对于MO1敲低表型与种系突变体中缺乏这种表型之间的原因，已经有多项研究给出解释：1）MO1剪接的脱靶效应【7】；2）为响应MO1而激活的固有免疫反应【8】；3）通过改变的起始密码子，核糖体移码或改变的剪接在突变体中产生功能蛋白【9】；4）最明显的是突变体中相关基因的上调,即“转录适应（transcriptional adaption）”【10】。最近的报道表明，转录适应是由无义介导的编码具有提前终止密码子蛋白质的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay）触发的【11】。因此，Tessadori等生成了三个新的prrx1a等位基因，包含阻止mRNA产生的大片段缺失。其中两个突变体通过删除TSS周围的外显子1和上游序列（prrx1ahu13685和prrx1ahu13762）产生，另一个等位基因prrx1ael803则包含一个7kb片段的缺失，涵盖TSS和所有外显子，均排除prrx1a mRNA和蛋白质的产生。
这些大片段缺失等位基因的纯合子胚胎在26 hpf时表现出正常的“cardiac jogging”，在50 hpf时表现出右旋心脏环化。因此，这一结果提示突变体mRNA介导的转录适应并不能解释MO1诱导表型与种系突变表型之间的差异。此外，将prrx1a-MO1注入缺乏prrx1a-MO1靶位的prrx1ahu13685 / hu13685突变体中，同样会在心脏环化中存在缺陷，进一步证实了其缺乏特异性。
为了更深入地了解MO1诱导的心脏环化缺陷的可能原因，Tessadori等分析了与Nodal相关的Spaw基因和lft2的表达。注射prrx1a-MO1的胚胎显示出这些左侧基因的异常表达或缺失表达。此外，注射prrx1a-MO1的胚胎在Kupffer囊泡中的纤毛数量显着减少，并且该器官中prrx1a的表达低于在该阶段可通过原位杂交检测到的mRNA的水平。因此可以推断prrx1a-MO1似乎更早地且非特异性地改变了Kupffer囊泡的结构，而不是破坏与Nodal相关信号传导下游的右旋心脏环化。
总的来说，Tessadori等表示没有发现prrx1a在建立驱动斑马鱼心脏环化的右旋信号通路中的作用。尽管转录适应可以清楚地解释某些基因的敲低和突变表型之间的差异，但在某些情况下（例如此处分析的心脏环化表型），MO1会产生不反映内源基因功能的非特异性效应。值得注意的是，也有报道称gRNA–Cas9会在斑马鱼胚胎中引起非特异性作用，且Tessadori等在研究中也发现prrx1a种系突变体缺乏由CRISPR–Cas9产生的prrx1a体细胞突变而出现的心脏环化表型【2】。Tessadori等在文章最后给出建议，即在解释由基因编辑获得的表型时应格外谨慎，尤其是在缺乏靶标基因功能先验知识的情况下，应尽可能使用移码和不经转录适应的较大转录本去除的种系等位基因对表型进行严格验证。
对于Tessadori等的质疑，Ocaa等在同期Nature杂志上进行了回复，主要针对两个问题：1）在prrx1a-MO1胚胎中观察到的中位心（mesocardia）表型是否是由于非特异性脱靶作用引起的；2）Prrx1a对于心脏偏侧性是否是可有可无的。
首先，Ocaa等提出在原始数据中，L-R细胞向中轴的不对称运动产生了不同的力，引起心脏后极向左侧移动，触发心脏的偏侧性【2】。此外，还表明细胞运动由诱导上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）的转录因子（Snail和/或Prrx）的L-R不对称激活（在右侧较高）介导，且这种细胞行为在斑马鱼，鸡和小鼠中都是保守的。
随后，Ocaa等为了进一步检测心脏表型的特异性，采用另一种方法生成prrx1a-crispant胚胎（G0）并使用经过优化以防止产生脱靶效应的Cas9蛋白【12】。这些胚胎显示出与先前描述的相同缺陷，即中位心（尽管外显率较低）和心房大小减小，也包括其他缺陷如较小的头部，这一表型也曾在prrx1a和prrx1b双重突变体中观察到。值得注意的是，Kupffer囊泡的纤毛和spaw的表达均正常，表明crispant胚胎没有在MO1诱发的突变体胚胎中观察到的Kupffer囊泡早期缺陷症状。
接下来，Ocaa等使用产生crispant胚胎同样的方法生成了一个prrx1a突变等位基因（prrx1ain69）。prrx1ain69转录本在外显子1上没有剪接位点，因此无法编码功能性Prrx1a蛋白，因此，in69突变等同于prrx1a功能丧失突变。类似于prrx1a 无效突变体hu13685，hu13762和el803一样，该突变体也未能显示出中位心，正如Tessadori等所提示的Prrx1a对于心脏偏侧性可能是非必要的，但这并不一定意味着Prrx1a不参与心脏偏侧。in69突变体的好处是，可以直接检查靶向prrx1a的RNA guides的特异性，因为基因组中不存在相应的guide序列。当向prrx1ain69纯合突变胚胎注入RNA guides时，没有显示出任何可检测到的缺陷，而将这些guides注入野生型同胞胚胎中时则会导致中位心的产生。因此，尽管不能完全排除脱靶效应的存在，但这些证据都支持这次在G0 crispant胚胎中观察到的中位心表型是靶向prrx1a基因的特定效应。
通过无义介导的mRNA降解或旁系同源物的激活引起的转录适应，这些机制被Tessadori等否定。但是值得注意的是，只要非同源基因具有相似的功能，也可以实现机制补偿。Ocaa等在前外侧板中胚层（anterior lateral plate mesoderm, ALPM）中发现的另外两个EMT转录因子基因snail1b和twist1a的瞬时L–R不对称表达模式，类似于prrx1a。此外，snail1b或twist1a的G0 crispant胚胎也显示出心脏偏侧性表型，并且先前已经证明Twist转录因子可以与斑马鱼和癌细胞中的Prrx1协同作用[4]。因此，三个EMT转录因子在心脏偏侧调节中相互配合，并且Snail1b和/或Twist1a可能补偿Prrx1a的缺失，如果这种推断成立的话，则说明缺乏Prrx1a对于斑马鱼心脏侧偏缺陷是重要的。
最后，Ocaa等提出他们所阐述的脊椎动物心脏偏侧化的机制，也类似的在小鸡胚胎（使用siRNA）和小鼠胚胎（使用条件突变体）得到了证明【2】。这种机制与以前提出的L-R不对称对心脏偏侧性心脏后极贡献的研究相一致【13】。总体而言，Ocaa等提出以上数据，包括先前对小鼠心脏发育的形态学，功能和计算研究均支持他们的结论，即脊椎动物心脏后极从中线的位移暗示了L–R EMT的差异。其他EMT转录因子是否能补偿Prrx1a的缺失，以及心脏后极向左移位后如何出现右旋心脏环化，值得进一步研究。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2674-1
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2675-0
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