做了 10 年的活细胞成像实验,我总结出了这些经验

subtitle 生物学霸 09-20 03:37 跟贴 3 条

近年来,活细胞成像活跃于生物学的各个领域。在它的加持下,研究者们可以实时或者在一段时间内观察细胞内部结构和细胞生理过程,从而加深对细胞运作过程的认识。但在各种实验操作和成像条件下,想要成功做好活细胞成像实验并不容易。

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实验前我们先了解一下,什么是活细胞成像,它有哪些作用?

通常,我们把使用延时成像技术开展活细胞研究简称为「活细胞成像」。通过活细胞成像技术,可以研究靶标参与的动态生命过程,酶活性、信号转导、蛋白与受体转运以及膜的再循环过程(内吞与胞吐)等动态进程都可实现检测。

总而言之,活细胞成像实验可以:

观察动态细胞过程的发生;

能多色检测同时研究多个细胞过程和功能;

获得更接近体内真实环境的结果;

实时追踪细胞生物分子和结构(及其变化);

观察细胞之间的相互作用;

了解细胞酶和其他胞质生物分子在细胞中的存在。

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我们在实验中又应该注意些什么?

众所周知,活细胞需保持在天然的生理条件范围内,包括 pH、温度、O2 水平和渗透压等等,维持细胞的健康和功能活性十分重要。

所以,实验设计和操作过程中需特别注意:

须通过特定方法实现以最小毒性标记靶标——无论是靶分子、细胞功能还是细胞状态;

活细胞通常很难允许某些大的检测分子通过;

移动的观察目标更难保持聚焦;

使用的检测技术是否对活细胞有损伤。

当然,随着实验需求不断变化,需要注意的点也会有所不同。

举例来说,研究细胞生长与细胞分裂的实验可能与研究受体激活等实验就具有明显不同的需求。

一些强健的永生化细胞系能在无专门环境控制的条件下忍受短时成像;

在某些短时成像实验中,使用较大的培养基体积可避免由于挥发所导致的渗透压和含氧量变化问题;

而对于长时成像研究,除了在培养基中添加碳酸氢盐缓冲系统外,使用带有加热模块可控制温度、湿度与 CO2 的小培养室或大温控箱来精确控制环境也十分重要。

随着活细胞成像的普及,对实验中荧光基团标记的要求也越来越高,活细胞成像实验如何实现更好的荧光标记?一起奉上如下注意事项:

如需长时间曝光,请尽量选择用更长波长的荧光试剂,长波长试剂只需较低的激发功率,具有更低的光毒性,可以提供更健康的细胞状态;

推荐针对特定的检测读值、光谱兼容性和信噪比对染色进行优化;

去除标记溶液,并使用新鲜配制的培养基冲洗,可减少背景荧光;

搭配多种荧光基团实现多重标记,推荐使用荧光光谱查看器,以确保荧光染料间光谱重叠最小。

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CellLight 荧光蛋白标记技术

Invitrogen CellLight 系列试剂非常适于标记活细胞中特定细胞结构,采用特有 BacMam 转导技术引入靶向荧光融合蛋白,无需繁杂的分子生物学操作,即用型试剂包装,只需将 CellLight 试剂直接添加到培养的细胞中一步操作,孵育过夜即可在第二天进行成像,信号可观察数天,可选多种颜色和细胞结构。

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采用 CellLight Tubulin-GFP 和 CellLight Actin-RFP 标记

CellTracker 细胞示踪染料

Invitrogen CellTracker 染料是一类多样化试剂,可简单快速的标记整个细胞形态和变化,无细胞毒性,只需孵育细胞 30 分钟左右,即可稳定观察荧光信号至少 72 小时(通常为 3 至 6 代)。

采用 Tubulin Tracker Green, MitoTracker Orange, CellMask Deep Red 和 Hoechst 33342 标记的 U2OS 活细胞

pHrodo 酸性指示剂荧光染料

Invitrogen pHrodo 酸性荧光染料可灵敏显示胞内结构中 pH 值的变化,当结合到葡聚糖、蛋白质或其他颗粒时,pHrodo 染料常用作活细胞内吞和吞噬内化和溶酶体小泡的高度特异性指示剂,且背景更低。


采用 pHrodo Red 染料标记的细胞吞噬观察

图文来源:赛默飞

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