有了这三项技术,90% 以上的「基因过表达」可以实现

subtitle 生物学霸 09-16 16:29 跟贴 9 条

基因过表达(overexpression,OE)以及敲降(KO、KD)是研究基因功能的常用技术,敲降的手段多种多样,如化学合成 siRNA、载体构建 shRNA、针对基因组 KO 的 cas9、针对 RNA 的 CRISPRi 等。

但 OE 的手段很少,大部分科研工作者只了解构建外源过表达、CRISPR-SAM 两种,那么还有没有其他新颖的方式呢?

还真有!答案就是 saRNA(small activating RNA),saRNA 是由 21 个核苷酸组成的小分子非编码 RNA,其结构和化学成分与 siRNA 相同,但作用机制完全相反,是通过靶向基因启动子区域,引发染色质构象的改变或者改变组蛋白及 DNA 甲基化修饰水平,从而引发转录激活作用1。

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saRNA 的分子机制

saRNA 机制在机体中是广泛存在的,细胞主要依靠 miRNA、piRNA 实现激活途径,如 mir-373 靶向 E-cadherin 和 CSDC2 启动子的激活2、果蝇中 piRNA 触发的转录活性3。

国内科研工作者早前以 p21-saRNA 向肿瘤细胞递送 p21-saRNA 评估抗肿瘤能力4(p21 基因下调是结直肠癌的标志之一),为后续治疗结直肠癌提供选项,效果如何呢?

作者以 p21-saRNA-322(322 对应启动子区域的相对位置,图 2)递送三种大肠癌细胞(HCT-116,HCT-116(p53 – / –)和 HT-29),通过 QPCR 以及 WB 检测了 p21 基因的表达(图 3),结果显示,saRNA-322 于 72 h 显著提升了 p21 的表达水平。

p21-saRNA-322 靶点设计示意图

p21-saRNA-322 上调大肠癌细胞 p21 基因的 QCPR,WB 实验

后续,作者以流式分析确认了 p21-saRNA-322 大肠癌细胞在 G 0 / G 1 期细胞发生周期停滞(数据见原文),并同时在动物水平,验证了 p21-saRNA-322 对于肿瘤发生的抑制性:

裸鼠成瘤及瘤体检测

(持续五周的裸鼠实验数据,每 3 天瘤内注射 a 组 PBS,b 组 Scramble RNA,c 组 p21-saRNA-322;(A)裸鼠成瘤;(B)肿瘤提取;(C)对肿瘤的重量、体积测量;(E)肿瘤切片 p21 染色)

由此可见,p21-saRNA-322 在三种大肠癌细胞都实现了 p21 基因的上调,并在细胞与动物水平实现了表型的改变。需要指出的是,同个 saRNA 在不同细胞系,促进水平是有差异性的。在 PC-3,HeLa 和 MCF-7 细胞中,与 saCON 相比,p21-saRNA-322 对 RNA 诱导分别为 12.5 倍,10.1 倍和 2.4 倍。

p21-saRNA-322 对三种细胞的表达提升水平

p21-saRNA-322 在多种细胞实现靶基因的上调在 E-cadherin 基因上得到了重现5,显示出 saRNA 机制在细胞是普遍存在的,这为进一步的基因治疗开发提供了可能性。关键蛋白表达的下降通常是许多疾病的主要原因,恢复细胞中这些蛋白表达的新技术有待开发。

目前主要手段有 mRNA、Crispr 激活、反义寡核苷酸和 saRNA。但是无法合成长片段的 mRNA、Crispr 受困于脱靶效应及递送方式,T7 体外转录的 RNA 可能产生异常的副产物,这些都限制了向基因治疗方向的运用。

而 saRNA 由于其序列较短、生产成本低且可控等因素,有进一步开发为药物的优势,当然也需要克服免疫原性、脱靶性,以及合适的递送方式(纳米递送、脂质体、外泌体等)这些问题6。目前处于开发中的 saRNA 如下:

开发中的 saRNA

对于科研人员,saRNA 提供了除过表达、CRISPR-SAM 两种常用技术之外的第三种思路,尤其是针对大基因无法构建包装的情形。

saRNA 可借助载体构建的策略,稳定构建于质粒及病毒载体中,以实现直接化学合成无法达到的长期高效地表达,且周期短、成本低。当然,saRNA 也有其弊端,如需要筛靶、只能激活细胞本底表型,无法表达突变型等。

三种 OE 方式对比

不同的 OE 表达方式适合不同情形的实验,虽然各有优劣,但 saRNA 对于单基因下调引发的疾病治疗具有广阔的开发前景。

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【参考文献】

1. Developing small activating RNA as a therapeutic: current challenges and promises

2. MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences

3. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi-associated piRNA in Drosophila melanogaster

4. Specific up-regulation of p21 by a small active RNA sequence suppresses human colorectal cancer growth

5. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells

6. Developing small activating RNA as a therapeutic: current challenges and promises

图文来源:吉凯生物

题图来源:站酷海洛

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