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外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种,大小在30-150nm,由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外,广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

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外泌体研究通常进行以下几个方面的实验:1.试剂盒或差速超速离心分离;2.透射电镜拍摄(TEM);3.纳米粒径跟踪分析(NTA);4.Western Blot检测蛋白标志物;5.外泌体高通量测序/芯片;6.外泌体标记或示踪;7.外泌体细胞功能检测;8.外泌体动物模型验证等。

其中,外泌体分离之后,需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。

(1)透射电镜鉴定法:简称TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。

(2)纳米颗粒跟踪分析法:简称NTA,该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

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(3)Western blot分子标志物检测:外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;细胞质蛋白,如肌动蛋白(Actin)和钙磷脂结合蛋白(Annexins);参与生物功能的分子,如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90),以及细胞分泌的特异性蛋白。

(4)外泌体高通量检测外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸,可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞,参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。

(5)外泌体标记或示踪:对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪,有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前常用亲脂性染料对外泌体进行标记,亲脂性染料主要包括两类,一是PKH67(绿色)和PKH26,二是DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。

(6)外泌体功能研究:将标记的外泌体加入受体细胞培养基中,与受体细胞进行共培养,观察细胞的功能变化,如细胞增殖、迁移与侵袭、细胞凋亡等;或者将外泌体注射入动物模型中,观察动物表型变化和检测动物相关指标。