NGS检测BRCA基因的要点总结及梳理。
乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA)是一种重要的抑癌基因，包括BRCA1和BRCA2。BRCA1/2基因是评估乳腺癌、卵巢癌等其他相关癌症发病风险的重要生物标志物，也是影响患者个体化治疗方案选择的标志物，因此BRCA检测具有重要的临床意义。在此，我们有幸邀请到来自复旦大学附属肿瘤医院病理科的周晓燕教授，周教授作为NGS规范化检测的先行者，从明确检测目的、了解临床病史、样本选择、NGS技术检测流程、检测结果注释及临床解读等多个方面对BRCA基因检测进行了详细的梳理和总结。
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明确BRCA基因检测的目的及样本选择
周教授提出，在临床的实际工作中我们首先要明确患者行BRCA检测的目的，是为了指导靶向治疗还是遗传相关风险的筛查，这对后续检测样本的选择及结果的解读分析是十分重要的。
对于遗传风险评估，我们需要了解被检测者的家族史，至少需要采集三代的家族史（包括患病和未患病），绘制家系图，这对检测结果中致病性的分析及发病风险评估是有重要参考价值的。另外一点需要注意的是要了解被检测者是否做过同种异体移植，有同种异体移植的情况下不适合做BRCA检测，容易出现假阳性的结果。
了解病史后，我们就要明确检测样本，对于胚系BRCA检测，可以选择血液、唾液、口腔拭子、指甲等样本，其中血液标本最常用。其优点是DNA质量高，相对稳定，缺点是血液检测无法检出体系BRCA突变，存在遗传性解读风险。体细胞BRCA检测是选取肿瘤组织，可以是石蜡包埋组织（FFPE）样本和新鲜组织样本，对于晚期病人无法获得肿瘤组织的也可以考虑用循环肿瘤DNA（ctDNA）来检测。在临床中我们用FFPE样本会更多一些，可全面检出胚系和体系BRCA突变，但FFPE样本的质量问题也不容易忽视。
目前根据专家共识BRCA1/2检测的推荐路径如下所示（图1）。
图1 BRCA1/2检测的推荐路径
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NGS技术检测BRCA基因的
具体流程及重要质控环节
BRCA1/2基因序列长，变异遍布于2个基因的全长，突变分散、变异形式多样，没有热点变异，检测难度较大。国内对于BRCA基因检测一般采用下一代测序(next generation sequencing, NGS)的方法。NGS技术检测BRCA基因的主要流程包括样本处理、DNA提取及质控、文库构建及质控、测序及质控和数据分析等。血液和肿瘤NGS检测的主要过程总结如图（图2）。
图2 血液和肿瘤NGS检测的过程总结
在本次报告中，周晓燕教授对NGS检测每个环节应着重注意的细节以及对应的质控重点进行了总结和梳理。
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样本处理及质控
该环节需要重视石蜡样本的质量问题，样本是否及时固定及固定的时间是最重要的影响因素，另外样本的保存时间、切片后及时封蜡、保存环境(室温、干燥、防挤压)等也不容忽视。所选取样本的肿瘤细胞比例应>20%，在实际工作中，肿瘤细胞比例越高越好。
基于组织的分子诊断，病理评估也不可缺少，需要明确标本来源、标本类型、 病变部位、病理类型、细胞百分比或细胞量等，必要时要进行肿瘤细胞富集，这与检测结果密切相关。
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DNA提取及质控
目前DNA提取的方法主要有人工手动提取和DNA自动提取仪提取。DNA提取过程中需注重在提高DNA提取效率的基础上做到防污染。DNA的质量和浓度对检测结果的准确性有重要影响，所以DNA的质量控制环节十分重要，需要从DNA纯度、浓度以及片段化程度进行充分评估。
DNA质控方法主要有Nanodrop、Qubit及Q-PCR、琼脂糖凝胶电泳及微胶电泳（Agilent生物分析仪）等。琼脂糖凝胶电泳可以检测样本的片段情况，对DNA质量进行评估，另外N/Q比值也可反应DNA的质量，该比值越小，质量越好。
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文库构建及质控
目前建库的方法主要有2种，即扩增子建库法和杂交捕获建库法。对于已建好的文库同样需要进行质控，主要用到微胶电泳（Agilent生物分析仪）和Q-PCR两种方法。文库质量控制内容主要看文库的浓度、片段长度、扩增效率等是否符合要求。
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测序、数据分析及质控
在数据产生和结果解读前，我们需要对测序质量进行评估，目前主要质控指标有比对回帖率、碱基质量Q30占比、平均测序深度、中位测序深度、文库多样性、插入片段长度(bp)、深度>(0.2x实际测序深度)区域占比等。针对检测结果，需要强调人工审核的重要性，审核内容包括突变的确定、低频突变需要明确支持性read数目及CNV的解释和污染可能性的评估等。
另外，数据储存也很重要，通常采用通用的FASTQ、BAM、VCF保存完成的log日志文件，保存至少15年，提倡额外备份保存 30-50年。
对于NGS检测的结果，必要时还需Sanger测序及检测大片段重排（LRG）的MLPA方法来进行进一步的验证。
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合理的对检测结果进行注释、临床解读及报告
检测结果的注释和临床解读的重要性不言而喻，我们需对基因名称（HGNC）、变异在染色体中的位置、变异频率、cDNA的Genbank号及突变类型（HGVS）等做详细注释。临床解读主要包括两种，一种是变异分析如胚系检测的致病性分析、体细胞检测的致瘤性、功能性分析等；另一种是临床意义分析，如评估发病风险、以及在疾病诊断、治疗、预后中的作用。
变异解读是BRCA基因检测结果分析中的关键步骤，为临床报告提供重要参考依据。根据变异的致病性可分为五类：5类-致病性、4类-可能致病性、3类-意义未明、2类-可能良性以及1类-良性（图3）。
图3 遗传变异致病性分类
周教授强调对于意义未明（VUS）可以进一步分析，可详细追踪受试者家族人员BRCA突变情况，进行大家系的分离分析（Segregation analysis）、明确是否与致病突变共存（co-ocurrence analysis）、是否发生于进化保守区、进行体外实验的功能学研究以及汇总该突变类型在中国人群中的发生频率等。随着证据的增多，VUS可能会升级或降级，这对患者来说具有重要意义。
最后，周晓燕教授强调了BRCA基因检测报告中必备的要素，包括基本信息、样本信息、检测方法、检测结果、变异分类、变异解释、质控信息、局限性等。严格把控NGS测序中的每个环节后，一份完整由专业解读人员撰写的BRCA基因检测报告才会到达医生手中，真正为患者提供准确的基因参考信息。
专家简介
周晓燕教授
医学博士，主任医师，博士生导师
复旦大学附属肿瘤医院病理科副主任
复旦大学附属肿瘤医院病理科分子病理室负责人
卫计委PQCC分子病理质控组副组长
中国医师协会病理医师分会分子病理组副组长
中华医学会病理学分会分子病理组副组长
全国卫生产业企管协会实验医学专委会病理专业委员会副主任委员
上海市医学会分子诊断专科分会副主任委员
上海市遗传学会遗传与分子诊断专委会副主任委员
上海市抗癌协会淋巴瘤专业委员会常务委员
上海市临检质控中心 分子诊断技术评审专家
上海市病理质控中心分子病理组组长
主要从事分子病理诊断及研究，致力于分子病理新技术建立、新项目开展及其质量管理
审批编号CN-45786；过期日期2021-2-28