每位科研人都曾经历过一段 WB 实验的黑暗岁月：一个个二十出头的青年被这位「中年大叔」整天按在地上摩擦…
这个噩梦现在回想起来依然胆战心惊～
这位诞生于上世纪 70 年代的大叔，四十多年来长盛不衰，至今仍然坐在蛋白质研究技术的「头把交椅」，但他身后从未缺少过批评与质疑。现在他正在遭遇一场「中年危机」——通过 Western Blot 进行半定量分析的准确性和重复性逐渐受到来自学界的质疑。
由于 Western Blot 环节众多，实验设计引入的变量或实验人员无意的操作误差都影响着结果的有效性，像不同的样品制备方法、不均一的转膜效率、抗体的浓度和质量等。更糟糕的是，Western Blot 是造假重灾区之一，这也使得主流期刊对文章中 WB 数据的要求越来越高，包括确保可重复性和定量准确性等。
那么，当面对这样一张 WB 结果，如何确保条带间差异真实反应了样品的生物学变化？
挽救 Western Blot 的「中年危机」
想获得可靠、线性的定量 Western Blot 数据，高质量的样品制备和优化的实验方案必不可少。但即便如此，在实验流程中也很难完全避免误差，这时就需要进行归一化分析（normalization），来让定量数据更为真实可靠。
归一化修正了什么
归一化是通过将靶蛋白相对于内参对照（Internal loading control）进行定量，以修正实验中非样品相关的系统误差，如所制备样品浓度不同、泳道间上样量不同、不均匀的蛋白转印。在此基础上，印迹中靶蛋白相对水平的变化才能有效指示样品间生物学差异。
归一化策略有哪些
经典常用——管家蛋白归一化：
基于管家蛋白（Housekeeping Protein，HKP）为内参的归一化是常用的蛋白印迹归一化方法，即选取 α-tubulin、β-actin 或 GAPDH 等内源性蛋白作为归一化的对照。虽然经典，但越来越多的研究表明这种方法存在 bug：
在多数样品中 HKP 高丰度表达，导致上样量内信号易饱和；
并非所有的细胞系或组织都会表达所需 HKP，即使表达，其表达量也会随组织类型和细胞状态发生改变；
在不同的处理条件下，如药物刺激后，HKP 的表达量可能会发生变化；
HKP 表达水平会受到细胞密度的影响。
因此，在进行基于 HKP 的归一化时，先决条件是确定不同实验条件和样品类型中 HKP 的表达恒定，还需要选择和验证合理的上样量，让靶蛋白和内参都处于线性范围。
新晋标准——总蛋白归一化
另一种方法是基于总蛋白的归一化（Total Protein Normalization，TPN）。TPN 需要对膜上所有蛋白进行均匀染色或标记、成像和分析，即将整个泳道中的蛋白信号作为内参。
相较于 HKP 归一化，TPN 不再依赖于单一蛋白的表达，可直接反应泳道间上样量和转膜效率的差异，线性范围更广，准确性和重复性更好，并节省了检测 HKP 表达的时间、精力和试剂成本，现在已逐渐被视作蛋白印迹定量的金标准，在主流期刊对 WB 数据的要求中得到体现。
「For quantitative comparisons, appropriate reagents, controls and imaging methods with linear signal ranges should be used」 – Nature
「Normalize signal intensity to total protein loading (assessed by staining membranes for total protein) whenever possible」 – Journal of Biological Chemistry
「House-keeping proteins should not be used for normalization without evidence that manipulations do not affect expression」 – Journal of Biological Chemistry
TPN 中几种总蛋白染色的方法各有优劣：
丽春红是一种可逆、快速的染料，但是有灵敏度差和稳定性低的问题，容易在膜上留下自发荧光残留物，所以不适用于荧光 WB；
考马斯染料的灵敏度理想，不过需要平行运行两块胶，难以确保重复性；
如果使用可逆荧光染料，需要在流程中增加染色脱色的步骤和成像次数，增加了操作的复杂度，有些染料需要在 IR/NIR 通道下成像，也限制了成像仪的选择；
使用免染技术可则省去染色脱色的步骤，但需要购买特殊的凝胶和搭配特定成像仪，并且需要在免疫印迹步骤前对总蛋白进行成像。
有没有灵活简单、既快又准的 TPN 方法
赛默飞通过 Invitrogen No-Stain 免染型蛋白标记试剂和 iBright 智能成像系统，可以让 TPN 信号获取更简单，定量结果更准确、数据分析更容易。
使用方式灵活简单
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No-Stain 试剂兼容任意凝胶类型以及 PVDF 和 NC 膜，适用于化学发光或荧光体系，可轻松融入现行 Western Blot 工作流程。标记操作也很简单。混匀试剂后，对凝胶或转印后的膜孵育 10 分钟，即可完成标记。
使用 No-Stain 试剂标记蛋白印迹的步骤
No-Stain 染色的信号可使用带有 UV、绿色 LED 、荧光光源（激发光范围～455-485nm）的多种成像仪来捕获，包括 iBright 系列成像系统。
定量结果更准确
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No-Stain 蛋白标记试剂可在更广的线性检测范围内实现精准的 TPN，避免了 HKP 信号饱和导致的无效结果；可检测到低至 20 ng 的蛋白条带，信号灵敏稳定；未结合蛋白的标记物不会自发荧光，确保优越的信噪比。
使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化。与 HKP 相比，在 HeLa 裂解物中使用 No-Stain 试剂进行归一化的准确度更高
一键捕获膜上靶蛋白和 TPN 信号
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iBright 系统通过内置「No-Stain」模块和功能强劲的分析软件，令图像捕获和归一化分析更易上手。只需根据屏幕提示分配好通道，系统即可自动拍摄各通道的图像并进行合并。
用各种试剂处理 HCT116 细胞后，WB 测定 p-AKT（Ser473）的相对含量，并用 No-Stain 试剂进行 TPN，在 iBright 上一键获得 merge 图像
直接计算归一化因子
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归一化因子和归一化条带数据可以直接在 iBright 系统上生成，并作为报告或原始数据导出，在电脑上进行数据处理（iBright 提供免费电脑版软件）。
将归一化处理的磷酸化-AKT 结果以诱导倍数形式呈现（处理组对比未处理组）
期望 Western Blot 技术经过效率和准确性的改善，能够继续伴随我们探索蛋白奥秘。
这个差异是真实的么？
是的，没错！
下载《用 No-Stain 试剂和 iBright 成像系统对 WB 数据进行简便、准确的归一化》应用指南，请点击阅读原文。
图文来源：赛默飞
题图来源：站酷海洛