细胞增殖检测你就知道MTT?你该学习了!

subtitle 唯问Justscience07-31 10:16

细胞增殖检测总结

细胞增殖是生物体的重要生命特征,是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。细胞增殖检测是基础医学研究中常用到的一种检测手段。细胞增殖的研究方法有很多,以下内容为细胞增殖检测方法的总结。

一、分子水平

研究细胞增殖的一种方法是观察增殖细胞中表达但非增殖细胞中不存在的特定蛋白质。细增殖相关的蛋白包括: Ki67,PCNA ,MCM。

Ki-67

Ki-67 是增殖细胞的相关抗原,其功能与细胞分裂密切相关,在细胞增殖中不可缺少。Ki-67 是一种非常受欢迎的增殖标志物,由于其在癌症中的诊断和预后能力,通常被用于病理实验室[1-2]。

PCNA

PCNA(增殖细胞核抗原)是一种分子量为36KD的蛋白质,在细胞核内合成,并存在于细胞核内,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反应细胞增殖状态的良好指标[3],但多项研究表明,评估不同来源肿瘤中的细胞增殖时,Ki-67 的敏感性和特异性更高。

MCM

MCM标志物日益受到关注,最新研究表明,相较 Ki-67 和 PCNA,MCM 可能是了解癌症预后的更好选择[4-5]。

二、细胞水平

检测增殖状态常用的细胞水平检测包括:MTT,XTT,WST-1,CCK-8,Brdu染色法,Edu染色法,RTCA(real time cell analyzer,实时细胞分析法)和克隆形成实验等。

MTTXTTWST-1CCK-8都用于间接定量增殖(呼吸)细胞的生化测定。

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CCK-8试剂中含有WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4-二磺酸苯) -2H-四唑单钠盐)它在电子载体 1- 甲氧基 -5- 甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS )的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。

EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性,通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。

EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内很容易 扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)即可有效检测,可有效避免样品损伤,在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。而BrdU需要变性DNA后才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构,影响了Hochest等染色,导致染色弥散,准确性降低等问题,逐渐被EdU取代。

RTCA(real time cell analyzer)实时无标记细胞分析技术

该技术术采用特殊工艺,将微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板的底部或细胞浸润迁移板的微孔膜,用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感系统。
当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时,这种改变与细胞的实时功能状态改变成相关性,通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息,包括细胞生长、伸展、形态变化、浸润及迁移、死亡和贴壁等。

细胞克隆形成实验

当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测,细胞克隆形成率即细胞接种存活率,克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

三、组织水平

1、检测分子标志物。

1)石蜡切片,用免疫组织化学方法(IHC)检测增殖相关的分子标志物(PCNA,Ki67和MCM)。

2)新鲜组织样本,Western blot或者qPCR检测蛋白, mRNA/lncRNA。

2、石蜡切片染色检测细胞形态和组织结构上的差异

四、动物水平

1、移植癌动物模型,记录移植瘤体的大小/体积,重量等参数。

2、分子检测,Western blot或者qPCR检测蛋白和RNA。

3、组织,免疫组织化学方法(IHC)检测增殖相关的分子标志物(PCNA,Ki67和MCM)。

五、临床样品

1、组织石蜡切片

2、血清

1参考文献

1. Oka, S., Uramoto, H., Shimokawa, H., Iwanami, T. & Tanaka, F. The expression of Ki-67, but not proliferating cell nuclear antigen, predicts poor disease free survival in patients with adenocarcinoma of the lung.Anticancer Res. 31, 4277-4282 (2011).

2. Li, L. T., Jiang, G., Chen, Q. & Zheng, J. N. Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer (Review).Mol. Med. Rep. 11, 1566-1572 (2015).

3. Bologna-Molina, R., Mosqueda-Taylor, A., Molina-Frechero, N., Mori-Estevez, A. D. & Sánchez-Acua, G. Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors.Med. Oral Patol.Oral Cir.Bucal 18, (2013).

4. Carreón-Burciaga, R. G., González-González, R., Molina-Frechero, N. & Bologna-Molina, R. Immunoexpression of Ki-67, MCM2, and MCM3 in Ameloblastoma and Ameloblastic Carcinoma and Their Correlations with Clinical and Histopathological Patterns.Dis.Markers 2015, 8 pages (2015).

5. Szelachowska, J. et al. Mcm-2 protein expression predicts prognosis better than Ki-67 antigen in oral cavity squamocellular carcinoma.Anticancer Res. 26, 2473-2478 (2006).

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