干货 | 在实验室里怎么骚操作才能得到完整纯净的 RNA?

subtitle 生物学霸07-31 03:57

完整、纯净的 RNA 是实验能继续顺利进行的重要保障,然而每每在实验室干活儿的时候,经常会听到一旁师弟师妹灵魂般的呐喊:

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为啥我的 RNA 又不行了???

分子实验室难免会遇到 RNA 降解、污染甚至提不出来的情况,今天我们不妨来聊聊,在实验室里怎么骚操作才能得到完整纯净的 RNA。

先说说RNA

核糖核酸(缩写为 RNA,即 Ribonucleic Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA 由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。单链的 RNA 分子不稳定,很容易被无孔不入的 RNA 酶降解。

现在知道了这一点,我们来对症下药。

我们实验室抽提 RNA 用的是某根公司生产的植物抽提 RNATRIzol 试剂盒,但是对着试剂盒无脑操作也不行,还是有一点点的规律可循的。

1. 实验材料准备和前处理。

RNA-free 的离心管、枪头、一次性手套、口罩等等硬件设备就不赘述了;新试剂瓶使用前酸浸泡过夜,冲洗干净,0.01% DEPC 水处理后高温灭菌;其他用具有条件的话一律紫外灭菌,双手戴手套前后喷酒精消毒。

植物材料以水稻举例。

如果不是特殊种子比如突变致死表型的,那么在温室里培养一下,让种子长成幼苗来提幼苗的 RNA 会比一般种子效果要好很多,毕竟活跃的细胞里面 RNA 含量比正在休眠的种子会稍微高一点,也有利于提取。

(PS:建议选择水稻生长周期为移植后 12-15 天的幼苗,经验表明此时提取 RNA 的效果相对比较好,每个离心管里面放上 3-5 片完整叶片,保证材料用量,太少也不行不是?拟南芥可以再多一些)

如果是突变体种子,不幸突变基因导致了致死表型,一点点小芽都发不出来的,从两个方面入手,一是浸种催芽,能让种子萌动一点就尽量萌动一点;二是加大种子用量,一个离心管里面多放几粒种子,稍稍富集一点也好,总比没有强,对吧。我自己的习惯是致死种子 10-12 粒左右,数量太多了后面也会有新的麻烦,比如过滤时堵塞过滤孔。

我自己提 RNA 一份的叶片,大概放这么多(Emmmm 其实是稍微有点多的)

粉碎打磨用的的钢珠有新的就用新的(刚买来没拆封的),最好实验室有一些专用的 RNA-free 的钢珠。坦白说,我虽然心里知道高温灭菌可能没有太显著的效果,不能使所有的 RNA 酶灭活,不过还是会在第一次把钢珠保存起来之前用 0.01% DEPC 水过一遍,然后高温高压灭菌,统一存放起来。专次专用。

2. 提取过程。

样品粉碎后加入裂解液,震荡取上清液,转移过滤。在过滤之前,因为粉碎的植物样品颗粒还是非常大,因此建议在转移之前,把离心管高速离心几分钟(我的做法是 12000 rpm,3-5 分钟),只小心地把上清液吸取转移即可,可以有效的避免过滤柱孔被堵住的问题。

酒精洗脱两次、Buffer RW1 洗脱后,DNAase I 混合液孵育。DNAase I 注意保存在 - 20℃的低温环境中,而不是和试剂盒一样放在常温里。混合液溶剂注意用 RNA-free Water 稀释。

Buffer RW1 和 Buffer RW2 溶液再次洗脱后,离心管不要立刻加入 RNA 洗脱液,现在离心机中空离 1-2 分钟,除净其他液体,然后加入 RNA 洗脱液。

一般试剂盒中提供的是 RNase-Free ddH2O,悬空滴入过滤柱的中央后,静置 1-2 分钟,离心得到 RNA 溶液。为了使它的浓度稍微大一点点,我会把得到的 RNA 溶液重新滴加在过滤柱的中央,再次静置、离心,这个步骤重复 1-2 次。

我自己在做实验的过程中,会拆一盒新的一次性塑料手套,每做一步换一双手套;口罩戴三层。

整个步骤全部在超净工作台中进行,就算求个心理安慰 / 手动狗头。

笔者的丑照(逃) 现在来看这个超净台的玻璃开得有点大了……

3. 保存方法。

如果试剂盒提供的 RNA-free Water 溶解 RNA,溶液要在 - 80℃冰箱里低温保存;如果是 75% 的乙醇溶液,在 - 20℃的环境里也可放置三个月到半年左右的时间。

后续用到 RNA 的实验应尽快进行,避免降解。

理论上讲 RNA 在超低温冰箱里保存时间应该比较长,但是经验来看,即使密封的很好,-20℃和 - 80℃冰箱大家每天都要拿样品、拿试剂,开开关关的,也难免污染得比较快,一星期左右就不好说有没有讲解了,所以 RNA 还是现用现提更合适。我个人习惯抽出半天把 RNA 提取搞定再进行后面的步骤,新鲜无污染的 RNA 用起来超爽啊。

我提的全都是水稻野生型的叶片,就没写序号,理论上还是写一下的好

4. 最后聊一聊 RNA 的纯度检测和浓度测定。

我们用的是 1% 琼脂糖胶对 RNA 的完整性进行检测 (上样量量最好要大于 200 ng) 。现提的 RNA 立刻点样跑胶的话,降解的不厉害一般影响不大。跑胶前给电泳槽换一下新的电泳缓冲液。如果提取的 RNA 完整,在胶面上应该可以看到 18S 和 28S 两条清晰完整的条带,28S rRNA 条带的强度应当大致为 18S rRNA 条带的两倍。如果两条条带缺失或非常弱,说明有可能是 RNA 出现了污染或降解。

渣图供大家吐槽 / 惭愧,最后那个孔竟然没跑出条带来……

RNA 的浓度用紫外分光光度计 (Nanodrop 我们实验室的品牌是 Thermo Fisher) 测定,理想情况下 A260/A280 = 1.8-2.0。

A260/A280 值小于 1.65 时,说明样品可能存在蛋白质、酚或多糖的污染。我们在第一步破碎裂解时,吸取上清液转移可能吸到了有机相,做这一步的时候除了注意小心吸取外,可以考虑适当减少植物样品的用量,增大离心力和延长离心时间,让裂解过程进行完全、充分。对最终得到的样品纯度要求比较高的话,可以重新用氯仿再抽提一次。除此之外,洗脱和溶解 RNA 时最好用试剂盒提供的 RNA-free Water 进行溶液,如果是自己实验室的去离子水,稀释过程也有可能导致结果偏低。

A260/A280 值大于 2.0 时,则可能是 DNA 污染或异硫氰酸没有除干净。DNA 污染看一下 DNAase I 是否失活,换用新的有良好的活性的 DNAase I 进行。

水稻叶片的话,老老实实按说明书进行,理想时提到的浓度 1000+ ng/ul 还是问题不大的。

归根结底,如果老板愿意给买昂贵的、进口的、更好用的试剂盒,何至于此啊?

分子实验一般是结果导向的,根据结果找原因,多数的原因应该大致就像这样了 。

要是你已经很小心很小心了,R NA 还是常常污染,我觉得就去可以庙里烧个香了,因为我进实验室门的时候,师兄对我说:

师妹呀,常心怀敬畏 ——实验室上方三尺有神明。

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